构建有方向性的应力纤维细胞模型探究基底加载对细胞形态、应力纤维及Rho蛋白影响

摘要

基底状态对细胞的生长有巨大的影响，细胞的形态决定细胞的生死，因此细胞的力信号一直是目前的热点问题，对于细胞的力学信号转导目前的研究分别从力信号和化学信号两大方面进行了研究，但目前都没有十分确切的理论对力信号的转导做出完整的解释，本文就细胞骨架对力信号的响应方面通过构建有方向性的应力纤维活细胞模型研究了拉伸对细胞骨架的影响，同时对与骨架调整相关的Rho蛋白在力加载的条件下在细胞内的分布进行了初步的探究。本文的研究结果为研究细胞与力的方向问题探究提供了一种新途径，对于进一步弄清细胞对力的响应、应力纤维的方向性的重排、Rho的信号通路的机理阐明具有一定的意义。
　　主要研究工作和结果如下：
　　①机械拉伸加载装置的加工制作
　　根据基底膜形变原理，自行研制了单轴细胞拉伸装置。实验装置由控制系统、机械系统、培养腔三大部分组成，能够满足对细胞加载的各种方式的单轴周期性拉伸加载方式。系统的综合评价表明：该装置运行稳定，温度可控，拉伸频率及应变大小可调（频率范围0.01-1.5HZ，应变范围0-50％），拉伸时间人为控制，操作简便，可对细胞进行不同频率、时间和应变大小的拉伸加载。
　　②构建有方向性的应力纤维活细胞模型
　　根据文献对细胞周期加载的研究，我们对ECV-304细胞进行了周期拉伸、周期拉伸后一定时间细胞的形态变化、应力纤维的变化进行了研究，明确了力的方向分别对细胞长径、短径方向上的影响，以及对应力纤维的影响。表明了细胞在停止周期拉伸后，细胞在一定的时间内细胞的形态和细胞内的应力纤维原有的平行排步方式是可以稳定保持的，利用周期拉伸的方式构建一定时间内稳定的有方向性的活细胞模型的方法是可靠的，是可以利用这一模型进一步的进行力对细胞取向影响的研究。
　　③对已规划应力纤维方向的细胞模型的静态拉伸研究
　　我们对已规划应力纤维方向的细胞模型在平行应力纤维方向施加10%的静态拉伸，实验的结果发现从细胞的形态观察30min时间内受力方向上的细胞响应为收缩，在非受力方向上没有明显变化，同时检测应力纤维发现其束状结构逐渐消失，纤维变模糊，纤维有解聚的现象。依据文献对细胞加载的研究，结合我们自己的实验我们对这一现象的成因解释为：一、由于基底的过大形变拉伸导致粘着结构同基底的脱粘附形成，使得细胞回缩，导致应力纤维的解聚；二、由于过大的应力通过骨架结构传递到细胞内引起了Rho的双重相关对抗的调节机制，通过对应力的反馈调节，使得应力纤维的解聚，使得细胞回缩。
　　④Rho蛋白在细胞内表达探究
　　通过免疫荧光实验对静态、周期拉伸情况下的细胞多次实验取样研究细胞内Rho的表达，我们发现Rho蛋白在细胞的细胞质和细胞核区域均有分布,在周期拉伸以后,这种分布没有肉眼可辨的明显的变化;静态细胞内的Rho蛋白的免疫荧光强度较弱，我们利用图象处理软件Quantity One软件检测细胞内的光密度值进行了统计分析发现周期拉伸后细胞内的Rho蛋白荧光强度上升,经T检验,P<0.01有显著的差异，表明经过周期拉伸后细胞内的Rho蛋白总量上升。由于细胞内有非特异性的染色结构出现在核区对细胞内长径、短径方向的光密度值测量影响较大，无法准确比较方向上是的差异性，根据我们肉眼观察，我们认为Rho蛋白无论是静态还是周期拉伸后在长、短径方向都没有明显差异。

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1 绪论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3本文研究的目的、意义以及主要内容

1.4技术路线

2 细胞培养基底伸张装置的加工制作

2.1 引言

2.2结构和原理

2.3实验材料

2.4 装置加工及调试

2.5 细胞学实验结果

2.6 讨论

2.7 本章小结

3 构建有方向的应力纤维活细胞模型

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂和仪器设备

3.3 实验方法

3.4 实验结果

4 已规划应力纤维方向的细胞模型的静态拉伸

4.1 引言

4.2 实验材料、试剂和仪器设备

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 小结

5 Rho蛋白在细胞内表达探究

5.1 引言

5.2 实验材料、试剂和仪器设备

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 讨论

5.6 小结

6 结论及展望

6.1 全文主要研究工作及主要结论

6.2 后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附 录