肝癌细胞粘附和收缩调节对Rho蛋白表达影响的实验研究

摘要

Rho蛋白是细胞内多条信号转导通路的关键分子，可参与对正常细胞增殖、分化、凋亡的调控，其表达受到细胞骨架功能状态的反馈调节。在肿瘤细胞中Rho蛋白表达普遍增高，Rho蛋白表达异常与肿瘤的发生和转移密切相关。由于肿瘤细胞骨架发育存在缺陷，由此导致的骨架功能异常与其Rho蛋白表达增高是否存在相关性。本课题研究细胞不同的粘附和收缩行为对Rho蛋白表达和细胞迁移运动特性的影响，从而探索肝癌细胞侵袭转移的过程机制。
　　目的：本文通过控制细胞粘附和收缩行为，比较正常肝细胞和肝癌细胞在不同预张力状态下其Rho蛋白表达变化的趋势，以及这种改变对细胞迁移、增殖特性的影响，这对揭示肝癌细胞迁移行为的胞内分子基础有一定意义。
　　方法：运用细胞形态学观察，免疫组织化学技术，分别对肝癌细胞，正常肝细胞Rho蛋白表达水平，以及FN裱衬前后肝癌细胞迁移运动能力进行检测和分析；通过免疫荧光实验技术对裱衬FN的不同粘附状态，用MLCK抑制剂ML-7作用下细胞的不同收缩状态，以及机械加载条件下肝癌细胞、正常肝细胞骨架变化和Rho蛋白表达分布进行检测和定量分析，从而了解细胞骨架结构功能状态对Rho蛋白表达分布的影响趋势，以及这些改变与肝癌细胞迁移增殖行为变化的相关性。
　　结果：（1）肝癌细胞 Rho蛋白的基础水平高于正常肝细胞；裱衬1-5μg/ml FN肝癌细胞Rho蛋白表达水平升高，裱衬10-20μg/ml FN Rho蛋白表达水平下降，但裱衬40μg/ml FN Rho蛋白表达水平开始上调；而在正常肝细胞中裱衬FN后Rho蛋白表达水平显著降低；（2）随着裱衬FN浓度的增加，HepG2肝癌细胞粘附率增加，对增殖的抑制作用越发明显；（3）裱衬低浓度FN（2μg/ml），细胞迁移运动能力明显增加，而高浓度FN（20μg/ml）时，细胞在1h的净位移和迁移轨迹离散度均减少；（4）MLCK抑制剂ML-7低浓度（6μM）使正常肝细胞Rho蛋白表达下调，而对肝癌细胞Rho蛋白无明显影响，ML-7高浓度（10μM）肝癌细胞骨架解聚，较正常细胞明显；两组细胞Rho蛋白表达减少；细胞迁移速率降低；（5）机械加载下细胞长短径比、球形指数、与主应变方向夹角均会发生变化，与静态对照组有明显差异；细胞骨架重排；肝癌细胞Rho蛋白表达明显增加。
　　结论：肝癌细胞Rho蛋白表达变化的反馈调节与细胞骨架结构和功能状态存在一定相关性，但其中不同粘附状态对肝癌细胞表达 Rho蛋白的反馈调节作用存在一定程度的失调；Rho蛋白表达水平与其迁移能力呈正相关。

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英文缩写词表（Abbreviation）

1 绪 论

1.1 国内外研究现状

1.2 问题的提出及研究意义

1.3 研究目的和研究内容

1.4 技术路线

2 肝癌细胞不同粘附状态与Rho蛋白表达变化的相关性

2.1 引言

2.2 实验材料、试剂和仪器设备

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

3 肝癌细胞骨架不同功能状态与Rho蛋白表达变化的相关性

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂和仪器设备

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

4 结论及展望

4.1 全文主要研究工作及主要结论

4.2 后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附录