水稻抗坏血酸过氧化物酶基因OsAPX1表达载体构建及功能分析

摘要

水稻是世界上人类赖以生存的主要粮食作物,随着环境条件的的日益恶化,严重影响到水稻品质和产量。在环境胁迫下植物体内容易产生大量的活性氧,造成活性氧在植物体内大量积累,如果不能及时清除体内积累的活性氧,就会破坏活性氧代谢平衡,引起植物氧化损伤,对植物造成损害。因此,清除植物体内积累的活性氧提高植物的抗氧化能力是目前抗氧化相关研究的主要领域。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物体内清除活性氧的一种关键酶,广泛存在于植物和一些藻类中。APX能清除植物体内过量积累的活性氧,有效的保护植物免受氧化作用造成的损伤。APX催化过氧化氢分解产生水,消除过氧化氢的强氧化作用。故APX能增强植物的抗氧化性,在氧化胁迫应答过程中发挥着重要的作用。在植物中,APX是一个多基因的家族,根据其在细胞中的位置不同可分为:叶绿体基质APX(sAPX)、线粒体APX、叶绿体类囊体APX(tAPX)、微体APX(mbAPX)和胞质APX(cAPX)。由于水稻基因组序列测序成功,根据水稻基因组序列知水稻含有8个APX家族成员。水稻中APX家族基因又可分成3种:APX1和APX2属于细胞质型;APX3和APX4属于过氧化体型;APX5、APX6、APX7和APX8属于叶绿体型。本研究选择水稻APX1基因为研究对象,克隆得到水稻OsAPX1基因,连接到植物表达载体pHB载体上,构建成过量表达pHB-OsAPX1载体,通过农杆菌介导的遗传转化法导入水稻基因组中,通过组织工程技术获得阳性转基因植株,然后分析转基因植株的表型,研究该基因的生物学功能。通过载体pHB携带的抗性标记基因鉴定APX1基因是否整合到水稻基因组中,鉴定结果表明APX1基因已经整合到水稻基因组中。对转基因植株进行半定量RT-PCR实验,结果表明在转基因植株中APX1的表达量明显增加。田间水稻抽穗灌浆期期处于高温期,分析其表型。转基因植株的田间表型分析表明高温条件下转基因植株相比野生型秕谷率明显降低,实验结果得出OsAPX1基因可能与水稻抗热有关。在高温热击和过氧化氢胁迫下,转基因植株相比野生型要长的好。高温热击胁迫下,转基因植株比野生型的耐热性强,表现为更高的苗长和更多的绿色鲜活部分。过氧化氢胁迫实验结果表明,与野生型植株相比转基因植有强的抗氧化性。综上所述,水稻OsAPX1基因在水稻抗热和抗过氧化氢应答中起了重要的作用,过量表达OsAPX1基因可提高水稻的抗热和抗氧化能力。OsAPX1能通过转基因技术整合到水稻基因组中,可以用作植物基因的改良,为提高水稻产量和培育抗逆水稻新品奠定基础。

目录

摘要

ABSTRACT

1 文献综述

1.1 引言

1.2 活性氧

1.3 活性氧代谢

1.3.1 酶促的活性氧代谢系统

1.3.2 非酶类的抗氧化系统

1.4 抗坏血酸过氧化物酶 APX 的研究进展

1.5 转 APX 基因的研究进展

1.6 植物抗逆的研究进展

1.6.1 植物盐胁迫的研究

1.6.2 植物抗氧化研究

1.7 农杆菌介导植物的遗传转化

1.8 研究的目地和意义

1.9 研究的主要内容和技术路线

1.9.1 研究的主要内容

1.9.2 研究的技术路线

2 水稻 OsAPX1 基因过量表达载体的构建

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.2 实验仪器与方法

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 OsAPX1 基因的克隆

2.3.2 重组子的菌落鉴定

2.3.3 pHB-OsAPX1 重组子的菌落 PCR 鉴定

2.3.4 pHB-OsAPX1 重组质粒双酶切鉴定

2.4 讨论

3 过量表达载体 pHB-OsAPX1 的遗传转化

3.1 实验材料

3.1.1 水稻品种

3.1.2 实验菌种

3.1.3 遗传转化材料

3.2 实验仪器与试剂

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 水稻胚性愈伤诱导培养基

3.3.2 农杆菌感受态制备

3.3.3 过量表达载体转化农杆菌

3.3.4 过量表达载体转化农杆菌的鉴定

3.3.5 水稻胚性愈伤的诱导和继代

3.3.6 农杆菌介导的水稻遗传转化体系

3.3.7 水稻胚性愈伤的筛选

3.3.8 抗性水稻愈伤的分化与转基因水稻再生

3.3.9 转基因植株的鉴定

3.4 结果与分析

3.4.1 农杆菌的菌落 PCR 鉴定

3.4.2 转基因植株的材料鉴定

3.4.3 转基因植株的 OsAPX1 半定量 RT-PCR 分析

3.5 讨论

4 OsAPX1 基因的表达与转基因植株的表型分析

4.1 材料、试剂与仪器

4.1.1 实验材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 转基因水稻植株的田间表型分析

4.2.2 转基因水稻 T0代种子的发苗实验

4.2.3 转基因幼苗的热击胁迫处理实验

4.2.4 转基因幼苗的过氧化氢胁迫处理实验

4.3 结果与分析

4.3.1 转基因水稻植株的田间表型分析

4.3.2 水稻幼苗热胁迫试验

4.4 讨论

致谢

参考文献

附录

A. 实验基本试剂配方

B. 已录用的文章

C. 参加的研究课题