绿僵菌双功能过氧化氢酶过氧化物酶基因MaKatG1的克隆与功能分析

摘要

绿僵菌(Metarhizium acridum)是一类重要的昆虫病原真菌，在生物防治中起到重要的作用。它具有通过宿主体壁侵染害虫这种独特的侵染方式，因此在防治刺吸式口器害虫中具有广泛的应用价值。绿僵菌孢子粘附到昆虫体壁后，在适宜的条件下会形成附着胞这种侵染器官，然后穿透体壁，进入血淋巴，最终致死昆虫。真菌体表侵染阶段决定着是否能侵染以及侵染快慢，因此对这一时期绿僵菌的致病机制进行研究，可以为提高真菌杀虫剂的效率提供依据。我们课题组构建了绿僵菌在附着胞形成阶段均一化cDNA文库，在已知基因组序列的基础上，我们克隆得到了绿僵菌双功能过氧化氢酶过氧化物酶基因MaKatG1，并采用基因敲除技术对其功能进行分析。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.MaKatG1的克隆与序列分析
　　 我们根据已知的绿僵菌基因组序列，克隆得到了双功能过氧化氢酶过氧化物酶基因并将其命名为MaKatG1，Genbank登录号为JN935023。该基因不含内含子，其开放阅读框为2205bp，编码一个含有734个氨基酸的蛋白。使用在线工具预测该基因的分子量为81kDa，理论等电点为5.88，而且不含信号肽。BLAST分析和进化树分析发现，绿僵菌的双功能过氧化氢酶过氧化物酶基因与其他真菌的过氧化氢酶过氧化物酶基因具有较高的同源性。
　　 2.采用基因敲除的方法对MaKatG1的功能进行分析
　　 为了研究该基因的生物学功能，我们构建了MaKatG1的敲除载体pK2-pB-KatG1，通过农杆菌介导的转化方法，将该载体转入到绿僵菌CQMa102菌株，对筛选得到转化子采用PCR分析和Southern blotting的方法进行验证，最终得到2个转化子菌株。
　　 3.MaKatG1，与绿僵菌的抗氧化能力有关
　　 分别将野生型菌株和敲除菌株接种到含有过氧化氢和甲萘醌的PDA平板，观察菌株在氧化条件下的生长表型，结果发现缺失MaKatG1这个基因后，菌株的生长受到明显抑制，并且随着氧化剂浓度的升高，这种抑制更明显。过氧化氢的毒性测试发现，野生型菌株的半致死剂量为6.3mM，而敲除菌株仅为1.8mM。
　　 4.MaKatG1编码的蛋白具有过氧化氢酶和过氧化物酶活性
　　 我们检测了敲除菌株以及野生型菌株的过氧化氢酶酶活和过氧化物酶酶活，发现敲除菌株的过氧化氢酶酶活和过氧化物酶酶活明显低于野生型菌株，在氧化条件下，这种差异更加明显。
　　 5.MaKatG1影响绿僵菌的毒力
　　 我们对野生型菌株和敲除菌株进行了生物学毒力测定，采用注射的方式侵染蝗虫，野生型菌株和敲除菌株的半致死时间没有明显差异，但是采用点滴侵染的方式侵染蝗虫，敲除菌株的半致死时间显著长于野生型菌株。结果说明该基因很有可能在侵染前期起作用。
　　 6.MaKatG1影响绿僵菌穿透体壁的能力
　　 用敲除菌株和野生型菌株分别采用点滴和注射的方式，对蝗虫进行侵染后，定时取血淋巴观察虫菌体的数量。实验发现，如果用注射的侵染方式，两种菌株侵染后蝗虫血淋巴的虫菌体数量基本没差异，但是用点滴侵染时，敲除菌株侵染的蝗虫血淋巴的虫菌体数量明显低于用野生型菌株侵染的蝗虫血淋巴的虫菌体数量。
　　 7.MaKatG1影响绿僵菌在活体蝗虫体表的萌发和附着胞形成
　　 我们将敲除菌株和野生型菌株的新鲜孢子分别接种到活体蝗虫翅膀和疏水性塑料表面，观察孢子的萌发率和附着胞形成率。在蝗虫翅膀，接种后18小时，敲除菌株的萌发率显著低于野生型菌株；接种后24小时，敲除菌株的附着胞形成率显著低于野生型菌株。但是在疏水性塑料表面观察不到这种差异，表明蝗虫体表可能存在一些物质，阻碍了敲除菌株的萌发和附着胞形成。
　　 8.MaKatG1影响绿僵菌对紫外的耐受性
　　 我们将野生型菌株和敲除菌株在紫外照射1-4小时后培养24小时，分析这两种菌株的相对萌发率，实验发现野生型菌株的相对萌发率随着紫外照射时间的增加而下降，然而敲除菌株的这种下降趋势更明显。