应力环境下成骨细胞差异基因表达及选择性剪接调控研究

摘要

生命有机体受应力调节的生长一直是人们关注的问题。许多细胞都响应力信号，包括内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等。应力可能引起这些力效应细胞在基因水平或表达水平的调控。由于细胞内的应力信号转导是一个异常复杂的过程，一系列的基因、受体和通路都参与其中，因此需要通过基因组水平的检测手段全面分析应力信号的生物学功能和作用机制。本研究利用基因表达系列分析(Long SAGE)的方法检测了应力刺激前后成骨细胞内的差异表达基因，并对这些基因进行了生物信息学分析，包括功能分析、基因本体论(Gene Ontology，GO)分析和信号通路分析，根据生物信息学的研究结果构建了成骨细胞力信号转导的调控网络。
　　 应力刺激能够改变成骨细胞内的基因表达，其中一种可能的机制是应力刺激对选择性剪接的调控。真核生物的基因表达需要经历转录后的修饰，才能产生成熟的mRNA进入胞浆，选择性剪接是转录后修饰的一种重要手段。本研究应用分子生物学的检测手段(实时定量PCR)鉴定了参与选择性剪接应力调控的剪接因子，检测了过载拉伸前后剪接因子的表达水平。剪接因子调控剪接功能的发挥与其自身的磷酸化水平密切相关，本研究通过检测过载拉伸前后剪接因子磷酸化激酶的表达，分析了参与选择性剪接应力调控的可能的磷酸化通路。主要研究内容和结论如下：
　　 ①成骨细胞体外加载模型的构建：成骨细胞的原代培养及鉴定结果显示，组织块贴壁法获取的成骨细胞形态良好具有成骨细胞的特征，可以用于后续试验：设计制作过载拉伸装置，本装置可以对成骨细胞施加大应变量的拉伸加载，加载后成骨细胞生长状态良好，单次加载获取细胞量大，能够满足基因组水平检测的需要。
　　 ②对成骨细胞施加不同参数的过载拉伸刺激，检测成骨细胞的生理行为：细胞周期检测结果显示，过载拉伸能够改变成骨细胞细胞周期分布，促进成骨细胞的增殖；ALP检测结果显示，过载拉伸能够抑制成骨细胞的分化；成骨细胞内钙分泌检测结果显示，过载拉伸刺激能够促进成骨细胞的矿化。
　　 ③对成骨细胞施加不同参数的过载拉伸刺激，检测成骨细胞内特异性基因的表达。结果显示，过载拉伸能够有效地调控成骨细胞的多种特异性基因的表达，从而对成骨细胞的生理行为，如增殖、分化和矿化进行调控。
　　 ④应用Long SAGE技术构建过载拉伸前后成骨细胞基因表达文库，对两个文库进行对比分析。结果显示，过载拉伸刺激后成骨细胞内显著上调的基因有100个，显著下调的基因有72个，表明应力刺激能够有效地调节成骨细胞内的基因表达。
　　 ⑤应用实时定量PCR的方法对Long SAGE文库进行可靠性验证。随机选取的6个差异表达基因的PCR检测结果与Long SAGE检测结果一致，说明LongSAGE文库提供的实验数据是真实可靠的，可用于生物信息学分析。
　　 ⑥差异表达基因的生物信息学分析：功能分析结果显示，受应力调控的差异表达基因主要调节细胞的蛋白质生物合成，信号转导，代谢，离子结合，发育，凋亡，细胞粘附，细胞骨架，细胞增殖和细胞运动等功能；GO分析结果显示，这些差异表达基因具有不同的GO分类和功能，同时应力刺激也将通过调控这些差异表达基因来调控成骨细胞的各个生理过程和行为；KEGG信号通路分析结果显示，差异表达基因参与的三条最主要的通路分别是核糖体通路，细胞粘附通路和细胞外基质-受体相互作用通路。
　　 ⑦根据过载拉伸前后成骨细胞内差异表达基因的生物信息学分析结果，构建了一个完整的、系统的成骨细胞响应细胞外应力刺激的信号转导网络，即细胞通过胞外基质感知应力刺激，随后激活与细胞膜结合的如整合素，钙离子通道，DAG，Wnt，BMP-6/TGF-β受体；导致与之相关的几种信号通路被激活，包括ECM-整合素通路，肌动蛋白通路，ERK1/2通路，BMP-6/TGF-β通路，Wnt通路，Ca2+调节通路和NO调节通路；最后这些力信号由细胞质传递进入细胞核，调节与前mRNA剪接相关的基因转录，细胞外基质组件，细胞骨架重组，成骨细胞增殖，分化和凋亡。
　　 ⑧选择性剪接应力调控机制分析：应力调控剪接因子的鉴定，以SR蛋白(ASF/SF2和SC35)和hnRNP蛋白(hnRNPA1)为研究对象，应用实时定量PCR手段检测过载拉伸前后两类剪接因子的表达。结果显示，应力刺激对与选择性剪接调控直接相关的两类剪接因子SR蛋白和hnRNP蛋白都有显著的调控作用，因此我们推测应力刺激可能通过剪接因子的表达来调控成骨细胞的剪接变异体表达；参与选择性剪接应力调控的磷酸化通路分析，应用实时定量PCR的方法检测了参与选择性剪接过程中SR蛋白磷酸化和去磷酸化相关的激酶的表达。实验结果显示，无论是细胞质内起作用的SRPK激酶，比如SRPK1和SRPK2，P13K激酶，还是在细胞核内发挥功能的CLK激酶，比如CLK1，PP1激酶，在应力刺激后的成骨细胞内都显著上调。根据剪接应力调控的磷酸化通路分析结果，初步构建了应力刺激对成骨细胞内选择性剪接过程中SR蛋白的磷酸化与去磷酸化的调控模型。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略词

1 绪论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 基因表达系列分析的研究与应用

1.2.2 转录后修饰－选择性剪接

1.2.3 应力刺激调控的选择性剪接研究现状

1.3 本研究的目的和研究内容

1.3.1 本研究的目的

1.3.2 本研究的主要内容

1.3.3 本文的创新点

2 成骨细胞的原代培养、纯化及鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要材料、试剂与仪器

2.2.2 成骨细胞的原代培养

2.2.3 成骨细胞的传代培养

2.2.4 成骨细胞的纯化

2.2.5 成骨细胞的鉴定

2.3 实验结果

2.3.1 原代成骨细胞形态学观察

2.3.2 纯化后传代成骨细胞形态学观察

2.3.2 成骨细胞鉴定结果

2.4 本章小结

3 过载拉伸装置的设计和制作

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 主要材料与仪器

3.2.2 拉伸装置的设计和制作

3.2.3 基底膜细胞接种

3.2.4 加载参数的选择

3.2.5 加载前后成骨细胞的形态学观察

3.3 实验结果

3.4 本章小结

4 过载拉伸对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 主要试剂与仪器

4.2.2 成骨细胞的接种与加载

4.2.3 细胞周期检测

4.2.4 细胞的碱性磷酸酶检测

4.2.5 细胞的胞外无机钙检测

4.2.6 BCA法测定蛋白质浓度

4.2.7 细胞总RNA提取

4.2.8 半定量RT-PCR检测细胞内基因表达

4.2.9 RT-PCR分析所用引物设计与合成

4.3 实验结果

4.3.1 过载拉伸对成骨细胞增殖的影响

4.3.2 过载拉伸对成骨细胞分化的影响

4.2.3 过载拉伸对成骨细胞矿化的影响

4.2.4 过载拉伸对成骨细胞特异性基因表达的影响

4.4 讨论

4.4.1 应力刺激与成骨细胞增殖

4.4.2 应力刺激与成骨细胞分化和矿化

4.4.3 应力刺激与成骨细胞特异性基因表达调控

4.5 本章小结

5 过载拉伸条件下成骨细胞LongSAGE文库的构建和验证

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 主要材料与试剂

5.2.2 主要仪器与设备

5.2.3 细胞培养及拉伸加载

5.2.4 LongSAGE文库构建

5.2.5 Real-time PCR验证

5.3 实验结果

5.3.1 总RNA提取

5.3.2 分离回收130bp双标签

5.3.3 分离回收40bp双标签

5.3.440bp双标签体的连接

5.3.5 LongSAGE文库概述

5.3.6 LongSAGE文库提供的差异表达基因

5.3.7 Real-time PCR验证

5.4 讨论

5.4.1 LongSAGE与其他高通量分析方法的比较

5.4.2 LongSAGE文库

5.4.3 LongSAGE实验结果的验证

5.4.4 差异表达基因分析

5.5 本章小结

6 过载拉伸调控的差异表达基因的分析

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 DAVID软件分析方法

6.2.2 GoSurfer软件分析方法

6.2.3 KEGG通路分析方法

6.3 实验结果

6.3.1 差异表达基因的功能分类

6.3.2 差异表达基因的GO分类

6.3.3 显著上调和显著下调的差异表达基因GO层次树分析

6.3.4 差异表达基因的KEGG通路分析

6.3.5 系统的成骨细胞中应力信号转导网络构建

6.4 讨论

6.5 本章小结

7 过载拉伸对剪接因子的调控

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 主要材料与试剂

7.2.2 主要仪器与设备

7.2.3 细胞培养及拉伸加载

7.2.4 总RNA提取

7.2.5 荧光实时定量PCR

7.3 实验结果

7.3.1 过载拉伸对MGF表达的调控

7.3.2 过载拉伸对剪接因子ASF/SF2表达的调控

7.3.3 过载拉伸对剪接因子SC35表达的调控

7.3.4 过载拉伸对剪接因子hnRNP A1表达的调控

7.4 讨论

7.5 本章小结

8 过载拉伸对剪接相关的激酶的调控

8.1 前言

8.2 材料与方法

8.2.1 主要材料与试剂

8.2.2 主要仪器与设备

8.2.3 细胞培养及拉伸加载

8.2.4 总RNA提取

8.2.5 荧光实时定量PCR检测过载拉伸前后剪接相关激酶的表达

8.3 实验结果

8.3.1 过载拉伸对SRPK1表达的影响

8.3.2 过载拉伸对SRPK2表达的影响

8.3.3 过载拉伸对CLK1表达的影响

8.3.4 过载拉伸对PI3K表达的影响

8.3.5 过载拉伸对PP1表达的影响

8.4 讨论

8.5 本章小结

9 主要结论与未来工作展望

9.1 主要结论

9.2 未来工作展望

致谢

参考文献

附 录

A 作者在攻读博士学位期间科研及发表论文情况

B 参加的科研项目情况