绿僵菌丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶基因MaSnf1和MaHog1的克隆及功能分析

摘要

绿僵菌是一类重要的昆虫病原真菌，它作为生物防治制剂具有环境安全性好和昆虫不易产生抗性等特点。此外，绿僵菌的寄主广泛性和广谱性使得其成为一种研究昆虫病原真菌侵染寄主过程的重要模式生物。然而，绿僵菌在广泛施用上也存在一些制约，如受环境影响大，杀虫速度较慢等。因此，研究昆虫病原真菌侵染致病的分子机制对生物防治具有十分重要的理论意义。昆虫病原真菌穿透寄主体壁需要蛋白酶、几丁质酶、脂酶等水解酶的降解作用，在昆虫血腔中也需要酸性海藻糖酶来降解昆虫体内的海藻糖产生葡萄糖为真菌提供生长所需的碳源。然而研究表明，以上大多数水解酶基因的表达均受葡萄糖的抑制。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Snf1在葡萄糖抑制途径至关重要，并对某些致病真菌的产孢和毒力有影响。昆虫病原真菌在侵染期间需要克服外界环境如热激和UV-B，寄主昆虫免疫防御如高渗透压和氧化应激，及行为变化如沙漠飞蝗的行为发热等各种压力。促分裂原活化蛋白激酶Hog1型MAPKs在感应环境变化上起到了重要的作用，并调节对各种胞外刺激作出反应的发育和分化过程有关的基因表达。
　　本文以绿僵菌为实验材料，在已知基因组序列的基础上克隆得到了丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因MaSnf1和MaHog1，并采用基因敲除及回复技术对这两个基因的功能进行了分析。
　　主要研究结果如下：
　　1.MaSnf1的克隆及功能分析
　　1.1.MaSnf1的克隆与序列分析
　　根据已知的绿僵菌基因组和cDNA序列克隆得到丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因MaSnf1，登录号为JQ728546，开放阅读框为2199bp，分别在编码区420、1340和2054位点含有84、64和117bp的三个内含子。该基因开放阅读框编码732个氨基酸多肽，分子量为82.5kDa，pI为6.69。通过分析序列预测 MaSnf1与其他压力-激活蛋白激酶一样含有保守的特征域——216-244位点的活化环（A-loop）——与激酶活性有关的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点。根据MaSnf1序列的生物学分析可知绿僵菌MaSnf1基因编码的蛋白属于SNF1/AMPK家族。
　　1.2.采用基因敲除和回复技术对MaSnf1进行功能分析
　　为了研究绿僵菌 MaSnf1基因的生物学功能，我们构建了敲除载体pK2-PB-MaSnf1L/R和回复载体pK2-Sur-MaSnf1。利用农杆菌介导的电转化方法获得敲除菌株和回复菌株。然后通过PCR和Southern blot技术对敲除菌株和回复菌株进行验证。
　　1.3.MaSnf1与绿僵菌的产孢量和孢子萌发有关
　　在PDA固体培养基上，敲除转化子（ΔMaSnf1）菌落大小显著小于野生型（WT）和回复转化子（CP）。通过测量统计，ΔMaSnf1的产孢量与WT和CP相比降低了50％左右，ΔMaSnf1的萌发率中时（GT50）延迟了约1.4h。说明MaSnf1与绿僵菌的产孢量和萌发有关。
　　1.4.MaSnf1与绿僵菌的抗逆性有关
　　在PDA固体培养基上，每一菌株通过UV-B和45℃热激处理0h、2h、4h和6h后于28℃继续培养20h。结果显示，随着 UV-B和热激时间的增加，ΔMaSnf1的萌发率显著低于WT和CP。说明MaSnf1的缺失增强了绿僵菌对UV-B和热激的敏感性。
　　1.5.MaSnf1与碳源利用有关
　　为了研究MaSnf1在绿僵菌碳源利用中的作用，各菌株培养于含有不同单一碳源（葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、半乳糖、海藻糖和麦芽糖）的液体贫瘠培养基（MM）中，发现在海藻糖和木糖作为唯一碳源的MM中ΔMaSnf1的生长与WT和CP相比显著减弱。说明MaSnf1与碳源利用有关。
　　1.6.MaSnf1缺失后降低了绿僵菌的毒力
　　以蝗虫作为寄主实验材料进行了体表接种和体内注射两种毒力测试，结果显示ΔMaSnf1的毒力显著降低，但并没有完全失去致病性。可以预测MaSnf1影响绿僵菌对寄主的体壁穿透和体内定殖过程。
　　1.7.MaSnf1影响绿僵菌在寄主血淋巴中的生长
　　为了研究MaSnf1对绿僵菌虫菌体在血淋巴中的分化和生长，我们对各菌株在昆虫血淋巴中的生长表型进行了活体和离体实验。观察发现体表接种6d后，蝗虫血淋巴中发现了大量的WT和CP虫菌体，但几乎没有发现ΔMaSnf1虫菌体。8d后在血淋巴中发现了大量的ΔMaSnf1虫菌体。体内注射实验也发现了相似的情况。显微观察各菌株在含有或不含血细胞的血淋巴中的离体培养情况，发现ΔMaSnf1虫菌体的生长弱于WT和CP。
　　1.8.MaSnf1影响绿僵菌在蝗虫后翅上的孢子萌发和附着胞形成
　　由于毒力测试发现MaSnf1影响绿僵菌体壁穿透过程，所以我们在蝗虫后翅上进行了孢子萌发率和附着胞形成率的测定。结果显示，虽然各菌株的芽管和附着胞在形态上相似，但ΔMaSnf1的孢子萌发和附着胞形成时间与WT和CP相比延迟了，并且附着胞形成率降低了50%左右。说明MaSnf1影响绿僵菌在蝗虫后翅上的孢子萌发和附着胞形成。
　　1.9.MaSnf1影响绿僵菌某些水解酶基因的表达
　　用qRT-PCR技术定量绿僵菌某些水解酶基因的表达量。通过定量统计分析，发现在附着胞形成时期，ΔMaSnf1中几丁质酶和蛋白酶的表达量与WT相比显著降低；在蝗虫体内定殖时期，ΔMaSnf1中酸性海藻糖酶（ATM）基因的表达量与WT相比显著降低。说明MaSnf1影响绿僵菌某些水解酶基因的表达。
　　2.MaHog1的克隆及功能分析
　　2.1.MaHog1的克隆及序列分析
　　根据已知的绿僵菌全基因组信息，我们克隆得到了一个基因MaHog1。该基因登录号为JQ691634，开放阅读框为1077bp，编码358个氨基酸，分子量为41.1kDa，pI为5.65。在MaHog1基因组DNA的57，181，376，487，640，1053，1200和1445编码区位点发现了76，65，67，53，56，68，61和53bp的共八个内含子。分析序列可知 MaHog1含有保守的压力激活蛋白激酶子域——171-173位点的TGY活化环——与激酶活性有关的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点。根据MaHog1序列的生物学分析可知绿僵菌MaHog1基因编码的蛋白属于Hog1/Sty1/p38MAPK家族。
　　2.2.采用基因敲除和回复技术对MaHog1进行功能分析
　　为了研究绿僵菌 MaHog1基因的生物学功能，我们构建了敲除载体pK2-PB-MaHog1L/R和回复载体pK2-Sur-MaHog1。利用农杆菌介导的电转化方法获得敲除菌株和回复菌株并通过PCR和Southern blot技术进行了验证。
　　2.3.MaHog1与绿僵菌对于高渗、氧化应激和高温耐受性及细胞壁抑制剂的敏感性有关
　　为了研究MaHog1对多种压力的反应，我们观察了在各种压力下的菌落形态。当在PDA培养基上培养时，各菌株之间的生长速率没有显著差异。在高渗透压条件下（PDA加入0.5M NaCl或1.5M sorbitol），ΔMaHog1的生长减弱。而且，与WT和CP相比，ΔMaHog1增强了对高温（35℃）和氧化应激压力（6mM H2O2）的耐受性，且ΔMaHog1对细胞壁抑制剂刚果红（CR）和荧光增白剂（CFW）产生了显著抗性。说明 MaHog1与绿僵菌对于高渗、氧化应激和高温耐受力及细胞壁抑制剂的敏感性有关。
　　2.4.MaHog1缺失后降低了绿僵菌的毒力
　　为了研究 MaHog1对毒力的影响，我们进行了体表侵染和体内注射两种毒力测试。结果显示ΔMaHog1的毒力显著降低，但并没有完全失去致病性。可以预测MaHog1影响绿僵菌对寄主的体壁穿透和体内定殖过程。
　　2.5.MaHog1影响绿僵菌在寄主昆虫血淋巴中的生长
　　为了研究 MaHog1对绿僵菌虫菌体在血淋巴中的分化和生长，我们对各菌株在昆虫血淋巴中的生长表型进行了活体和离体实验。观察发现体内注射5d后，蝗虫血淋巴中发现了大量的WT和CP虫菌体，但几乎没有发现ΔMaHog1虫菌体。8d后在血淋巴中发现了大量的ΔMaHog1虫菌体。体表侵染实验也发现了相似的情况。对各菌株在血淋巴中的离体培养情况进行显微观察发现ΔMaHog1虫菌体数量显著少于WT和CP。说明MaHog1影响绿僵菌在寄主昆虫血淋巴中的生长。
　　2.6.MaHog1与绿僵菌在蝗虫后翅上的孢子萌发和附着胞形成有关
　　由于毒力测试发现 MaHog1影响绿僵菌体表穿透过程，所以我们在蝗虫后翅上进行了孢子萌发率和附着胞形成率的测定。结果显示，虽然各菌株的萌发管和附着胞在形态上相似，但ΔMaHog1的孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。测定各菌株的孢子疏水性，显示MaHog1不影响绿僵菌的细胞表面疏水性。

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中文摘要

英文摘要

目录

1绪 论

1.1引言

1.2研究背景

1.3立题依据及研究目的

1.4研究内容

1.5技术路线

1.6本研究创新之处

2绿僵菌MaSnf1的功能研究

2.1主要材料

2.2主要方法

2.3结果与分析

2.4讨论

3 绿僵菌MaHog1 的功能研究

3.1 主要材料

3.2主要方法

3.3结果与分析

3.4讨论

4 主要结论及后续工作展望

4.1 主要研究结论

4.2 后续试验建议

致谢

参考文献

附录

A. 序列

B．缩略词

C．引物序列

D. 作者硕士学习期间发表论文目录