成骨细胞对I型胶原三维结构的影响及其胶原的自组织

摘要

在体内环境中，成骨细胞能够分泌胶原，并与其他细胞共同作用，使胶原形成有序的骨雏形，随后羟基磷灰石等无机盐沉积其上，最终发育成为骨组织。如果这种细胞对胶原的作用能够在体外得到重现，就有可能用于骨组织工程材料的设计和制作过程。这是一种仿生制造的新思路，值得探索。
　　本实验希望通过考察成骨细胞与I型胶原之间的相互作用，探索其规律，从而探讨这种可能性。
　　本实验采用自行提取SD大鼠尾腱I型胶原，并配制成溶液形式。将原代培养的成骨细胞与所提取的胶原进行共培养，从细胞形态、增殖、生理功能等方面考察胶原三维结构对细胞生理功能的影响，同时采用组织染色、扫描电镜、Micro-CT等手段来考察细胞对胶原三维结构的改变能力，为探索细胞与材料之间自组织能力提供一定的理论依据。
　　主要工作如下：
　　①胶原的提取、纯化和鉴定：采用Schor提取法，提取并纯化了SD大鼠尾腱I型胶原，通过红外光谱分析，SDS-PAGE电泳分析，HE染色和Masson染色以鉴定所得胶原的结构和提取纯度。结果显示，提取物与生友生物公司的I型鼠尾胶原具有相同的分子结构和分子量大小；染色图片分析结果表明与I型胶原的组成相同。
　　②成骨细胞原代培养和鉴定：采用组织块培养法，体外培养新生的Wistar大鼠的成骨细胞。光镜观察细胞呈现矮柱状或立方形，表明细胞状态良好。用茜素红染色结果表明细胞具有的钙质分泌能力，具有成骨细胞的生物学特性。
　　③ I型胶原对成骨细胞形态，增殖等生理功能的影响：设置0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、5.0mg/ml、8.0mg/ml共8组胶原浓度的实验组，用扫描电镜考察胶原的三维结构。发现不同浓度的胶原三维网络状结构有所区别，并非成线性变化，总体趋势是随着浓度的增加，胶原内部孔隙（以直径量度）减小，单位面积内孔数增加。采用DAPI染色法，MTT法，及ALP试剂盒检测这8组浓度胶原对成骨细胞形态、增殖存活等生理功能的影响。将成骨细胞接种于胶原内部，取培养2，4，6，8天样本进行MTT检测，绘制生长曲线结果显示，不同胶原浓度内细胞生长曲线有所不同。成骨细胞在各组浓度胶原内部都具有增殖能力，其中，低浓度胶原内细胞活性明显大于高浓度内细胞。取培养2，4，6天样本测试其中细胞碱性磷酸酶活性，通过碱性磷酸酶活性变化率表可以发现，不同胶原浓度内细胞活性都有增长趋势。其中，低浓度胶原内细胞活性明显大于高浓度内细胞。将细胞生理功能结果与不同浓度胶原三维结构结果进行对比发现，I型胶原网络结构中孔径及单位面积孔隙个数能够影响成骨细胞生理功能。低浓度时，胶原网络结构孔径较大，单位面积孔隙个数较少，成骨细胞增殖，碱性磷酸酶等生理功能活性较大。高浓度时，胶原网络结构孔径较小，单位面积孔隙个数较多，成骨细胞增殖，碱性磷酸酶等生理功能活性较小。
　　④成骨细胞对I型胶原形态的影响：细胞接种于胶原内部，设置对照组为相同浓度的胶原溶液，培养2，4，6天后采用DAPI和HE染色，Micro-CT，扫描电镜考察成骨细胞对I型三维结构的改变。结果显示：成骨细胞对胶原有明显的收缩作用，使胶原内部孔径显著减小，同时在其表面沉积较厚的物质，对胶原三维结构改变较大。成骨细胞附近的胶原脉络具有成有序的平形状排列方式的趋势，对照组中胶原脉络均匀分布，无明显的聚集或发散趋势。

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中文摘要

英文摘要

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主要缩略词及中英文对照

1 绪 论

1.1问题的提出及研究意义

1.2本文的研究目的和研究内容

1.3本文的创新点

2 鼠尾Ⅰ型胶原提取纯化

2.1前言

2.2实验材料和方法

2.3结果与讨论

2.4本章小结

3 原代成骨细胞的体外培养

3.1前言

3.2实验材料和方法

3.3结果与讨论

3.4本章小结

4 Ⅰ型胶原对成骨细胞形态，增殖等生理功能的影响

4.1前言

4.2实验材料和方法

4.3结果与讨论

4.4本章小结

5 成骨细胞对I型胶原形态的影响

5.1前言

5.2实验材料和方法

5.3结果与讨论

5.4本章小结

6 结论和后续工作展望

6.1结论

6.2后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A. 实验室配制试剂

B. 作者在攻读学位期间发表文章

C. 参与的科研项目