家蚕幼虫中Hsp70家族的鉴定以及对非生物应激的诱导表达模式

摘要

热激蛋白Hsp70s（heat shock protein 70s）广泛存在于生物体中，它在蛋白折叠以及阻止蛋白变性的过程中扮演重要角色。本研究中，我们对鳞翅目的家蚕（Bombyx mori）基因组中的热激蛋白Hsp70s进行了同源比对检索，共鉴定出11个Hsp70s成员。将家蚕11个Hsp70s氨基酸序列在黑腹果蝇﹑帝王蝶﹑意大利蜜蜂﹑冈比亚按蚊和赤拟谷盗五个物种预测的蛋白数据库中进行本地Blastp比对，共鉴定出56个Hsp70s同源性基因。其中黑腹果蝇热激蛋白家族有13个Hsp70s基因，帝王蝶的有10个Hsp70s同源基因，冈比亚按蚊有9个Hsp70s同源基因，意大利蜜蜂有6个Hsp70s同源基因，而赤拟谷盗的同源Hsp70s基因最多（18个）。以家蚕和其他五种昆虫的Hsp70s的蛋白序列构建系统发生树，结果表明Hsp70s在进化上可归为两簇，为别为HSP70（Heat shock induced proteins 70）和HSC70（Heat shock cognate proteins 70）。
　　根据果蝇的命名规则，我们将家蚕11个Hsp70s基因进行了命名，包括3个诱导型的热激蛋白Hsp70s（Hsp68,Hsp70A和Hsp70B）以及8个组成型热激蛋白（Hsc70-2,Hsc70-3,Hsc70-4,Hsc70-5,Hsc70-6,Hsc70-7,Hsc70-8和Hsc70-9）。通过与家蚕数据库（SilkDB）blast比对，将家蚕的Hsp70s定位于对应的染色体上，发现家蚕Hsp70s共分布于8条染色体上。诱导型热激蛋白Hsp70s的Hsp70A、Hsp68和Hsp70B基因串联分布在第27条染色体上；组成型基因Hsc70-5和Hsc70-6均位于第15号染色体上并且也呈串联分布；其余HSC70分别分布于不同的染色体上。
　　我们对Hsp70家族成员在家蚕五龄第三天幼虫九个组织中的表达模式进行了分析，RT-PCR结果表明9个Hsp70s具有表达信号，其中3个诱导型的HSP70表现出组织特异性表达模式，8个组成型热激蛋白基因中只有3个（Hsc70-3,Hsc70-4和Hsc70-5）表现出在每个组织都表达的现象，即不是每个组成型HSC70基因都能在家蚕幼虫所有组织中表达。经过37oC和42oC的高温刺激，我们对五龄第三天家蚕幼虫的血液、中肠、脂肪体和丝腺中Hsp70s家族成员的诱导表达情况做了半定量PCR和荧光定量PCR分析，结果显示Hsp70A,Hsp70B,Hsp68和Hsc70-4相对于对照组均被诱导表达，并且它们的最高诱导上调表达量分别为607.1倍,1987.3倍,4147.3倍,以及7.5倍。而当家蚕幼虫在2oC的低温条件刺激时，Hsp70A,Hsp70B和Hsp68基因的表达量也在某些组织中被显著诱导增加。此外，对家蚕幼虫从五龄第三天开始分别喂食三种有机磷杀虫剂不同剂量浸泡过的桑叶，并分析了中肠、脂肪体和丝腺中Hsp70s家族成员的诱导表达情况，半定量PCR结果显示Hsp68基因能够被低浓度以及高浓度的敌敌畏（40mg/L和80mg/L）和辛硫磷（0.375mg/L和0.75mg/L）明显诱导。因此，家蚕Hsp70s家族成员不仅在热刺激以及冷胁迫下有表达量变化，还能够被有机磷杀虫剂诱导表达。
　　诱导型的热激蛋白可能在遭遇外界不良环境刺激时比组成型热激蛋白产生更强烈的应激反应从而发挥更重要的作用，并且在家蚕遭遇不利生长环境时这些Hsp70s的应激反应可能提高家蚕经济性状。

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缩 略 词

1 绪 论

1.1 引言

1.2 研究背景

1.3 研究目的与意义

1.4 研究的主要内容与技术路线

1.5 创新之处

2 家蚕Hsp70s家族成员生物信息学分析及组织表达模式鉴定

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 在冷/热刺激下家蚕Hsp70s家族的诱导表达模式

3.1 试剂与材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 家蚕Hsp70s家族对三种常用杀虫剂的应激反应

4.1 试剂与材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 结论与展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读硕士学位期间发表及参与发表的论文