粉尘螨舌下含服疫苗对粉尘螨变应原诱导的变态反应性哮喘的实验研究

摘要

目的： 探讨标准化粉尘螨舌下含服疫苗和辅以壳聚糖纳米粒子为佐剂的粉尘螨舌下含服疫苗对粉尘螨变应原诱导的变态反应性小鼠哮喘模型的免疫治疗疗效及作用机理。为标准化粉尘螨舌下含服疫苗以及粉尘螨壳聚糖纳米舌下含服疫苗的研制及产业化奠定基础。 内容与方法： 1、将24只Balb/c小鼠随机分为4组：阴性对照组(A组)、PBS对照组(B组)、低剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗组(C组)、高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗组(D组)。A组始终采用生理盐水处理。其余各组小鼠用粉尘螨变应原致敏后，分别用相应试剂对小鼠进行了舌下免疫，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中IgA、IgE与IgG2a抗体及脾细胞因子变化。 2、雌性Balb/c小鼠24只，将动物随机分为阴性对照组(A组)、模型对照组(B组)、低剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗组(C组)和高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗组(D组)，每组6只。A组始终采用生理盐水处理，其余各组用粉尘螨变应原致敏后，小鼠被分别给予相应试剂进行舌下治疗，再用粉尘螨变应原滴鼻激发；末次激发24小时后，检测气道高反应 (airway hyper-reactivity，AHR)；通过HE染色 (haematoxylin and eosin) 和AB染色 (Alcian B1ue) 观察小鼠肺部炎症和粘液分泌；观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类；用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)及血清中的Ign、IgE和IgG2a抗体；同时检测脾细胞在变应原特异刺激下分泌的IL-10、IL-4和IFN-γ水平；MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况，用流式细胞仪检测脾淋巴细胞中的调节性T细胞数量。 3、通过沉淀/凝聚法制备粉尘螨壳聚糖纳米粒子，检测粒径、包封率；琼脂糖凝胶电泳和红外光谱(FT—IR)检测纳米粒子包裹情况；用 Western-Blot 法检测粉尘螨变应原结合壳聚糖后的活性变化；观察其体外释放情况。用异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记模式蛋白质BSA，Sephadex G25纯化获得荧光标记蛋白，制备TRITC标记：BSA壳聚糖纳米粒子，将该纳米粒子舌下含服给予小鼠，运用激光共聚焦显微镜观察不同时间段小鼠粘膜、颈部淋巴结和胃肠道中荧光物质的变化。 雌性Balb/c小鼠30只，将动物随机分为阴性对照组(A组)、模型对照组(B组)、空白壳聚糖纳米组(C组)、标准化粉尘螨舌下含服疫苗组(D组)和粉尘螨一壳聚糖纳米舌下含服疫苗组(负荷与D组等剂量的粉尘螨变应原)(E组)，每组6只。Saline组始终采用生理盐水处理。其余各组用粉尘螨变应原致敏后，小鼠被分别给予相应试剂进行舌下治疗，再用粉尘螨变应原滴鼻激发；末次激发24小时后，检测气道高反应(AHR)，通过HE染色和AB染色观察小鼠肺部炎症和粘液分泌；观察BALF中细胞总数和细胞分类；用EIASA法检测BALF中IL-10、IL-4、IFN-γ及血清中的IgA、IgE和IgG2a抗体；同时检测脾细胞在变应原特异刺激下分泌的IL-10、IL-4和IFN-γ；MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况，流式细胞仪检测脾淋巴细胞中的调节性T细胞数量。 结果： 1、高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗通过舌下免疫已致敏Balb/c小鼠能明显诱导粘膜免疫应答IgA抗体产生，降低变应原特异性IgE，脾细胞因子以IL-10为主。 2、高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗能有效抑制变应原诱导的气道高反应性、炎症细胞侵润和粘液分泌；降低BALF中IL-4浓度，升高IL-10的水平；能升高小鼠血清中变应原特异性IgA抗体，抑制变应原特异性IgE产生；在粉尘螨变应原刺激下，高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗的小鼠脾细胞主要分泌IL-10，脾细胞变应原特异性增殖受抑制，调节性T细胞的数量比模型对照组显著升高。 3、成功制备了粉尘螨壳聚糖纳米粒子，壳聚糖对粉尘螨变应原的包裹率60％，负荷率为15.6％。变应原被成功结合到壳聚糖上，活性基本不受制备过程的影响。 异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的BSA壳聚糖纳米粒子，通过舌下含服给药，显示1小时内在粘膜下出现荧光标记物，荧光标记物可被肠道吸收。以壳聚糖为佐剂的粉尘螨变应原舌下含服疫苗能有效抑制变应原诱导的AHR、炎症细胞侵润和粘液分泌；明显降低BALF中IL-4浓度，升高IL-10和IFN-γ的水平，能升高小鼠血清中抗原特异性IgA抗体，抑制IgE产生；小鼠脾细胞在粉尘螨变应原刺激下主要分泌IFN-γ、IL-10，且脾淋巴细胞中的调节性T细胞数量比模型对照组增高。 结论： 1、高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗免疫致敏Balb/c小鼠，能明显诱导IL-10生成，诱导变应原特异性IgA抗体产生，而抑制特异性IgE抗体生成。 2、高剂量标准化粉尘螨舌下含服疫苗，通过诱导调节性T细胞、IL-10和特异性IgA抗体，抑制Th2型免疫应答和血清IgE抗体，减轻粉尘螨变应原诱导的变态反应性哮喘症状。 3、以壳聚糖为佐剂的粉尘螨舌下含服纳米疫苗免疫治疗，能够促进舌下粘膜吸收，诱导调节性T细胞、IL-10和特异性IgA抗体，产生以Th1为主的免疫应答，有效抑制变应原诱导的AHR、过敏性气道炎症和血清IgE抗体的产生。因此，是一种很有应用前景的疫苗。

目录

主要英文缩略词表

前言

第一部分标准化粉尘螨舌下含服疫苗对小鼠免疫系统的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分标准化粉尘螨舌下含服疫苗对变态反应性哮喘的作用机理研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分粉尘螨-壳聚糖纳米舌下含服疫苗对变态反应性哮喘的作用机理研究

前言

第一节壳聚糖的制备和表征

材料与方法

结果

第二节荧光标记蛋白纳米粒子舌下含服示踪研究

材料与方法

结果

第三节粉尘螨壳聚糖纳米疫苗对粉尘螨变应原诱导的变态反应哮喘的作用及机理

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 调节性T细胞与哮喘

树突状细胞和哮喘

致谢

博士期间发表的论文、申请的发明专利及博士生期间参与的科研工作