FMR1基因敲除小鼠感觉皮质管状区神经元树突与树突棘可塑性的研究

摘要

脆性X综合征(fragileXsyndrome，fra(X))是最常见的遗传性智力低下性疾病之一。致病基因-FMR1基因(fragileXmentalretardation1)三核苷酸重复序列动态突变及甲基化异常导致其编码产物脆性X智力低下蛋白(fragileXmentalretardationprotein，FMRP)减少或缺失。脆性X综合征小鼠模型通过在小鼠FMR1基因的第五外显子处插入新霉素表达片断而成功阻断了FMRP全长的表达。形态学研究发现脆性X综合征患者和FMR1基因敲除小鼠中神经元树突棘呈明显细长、扭曲的幼稚形态，成年脆性X综合征模型小鼠树突分支异常，不成熟的树突棘形成突触的能力严重受损。研究指出，树突与树突棘具有行为依赖可塑性，树突与树突棘的形态可以对突触特异性传入信息作出反应。目前许多研究表明，FMRP作为一种mRNA结合蛋白，可以于突触刺激后迅速在突触局部合成，通过结合多种参与神经元树突与树突棘形态改变的蛋白的mRNA来调节这些蛋白的表达，影响神经元树突与树突棘形态。FMRP缺乏时树突棘形态的异常被认为是导致神经精神疾病的基础。行为学研究认为脆性X综合征患者存在有视觉运动整合障碍、不同程度的智力低下、注意力缺陷和焦虑等社会行为的异常；而脆性X综合征小鼠行为学研究主要发现视空间记忆能力的下降，活动兴奋性增加等，缺乏对其胡须行为的进一步行为学研究。对胡须行为的进一步研究将有助于对脆性X综合征中感觉运动整合功能的研究。Barrelcortex区是小鼠面部胡须的皮质感觉中枢，由于其胡须感觉传导的一一对应关系而常被用于神经元行为依赖可塑性的研究。观察胡须行为学刺激后脑内Barrelcortex区神经元树突与树突棘的形1态学改变，有助于进一步了解脆性X综合征中神经元树突与树突棘的行为依赖可塑性是否存在异常，以及FMRP在神经元树突与树突棘的行为依赖可塑性中的作用及其作用机制。 材料与方法：首先对FMR1基因敲除小鼠(KO型小鼠)和野生型小鼠(WT型小鼠)进行基因型及蛋白表型的鉴定。进行胡须物体表面鉴别实验，选择成年(7周龄)WT及KO型小鼠各15只，单盲法观察两种不同基因型小鼠获得达标行为的天数，来研究KO型小鼠是否存在不同的胡须行为表现。进一步行小鼠胡须刺激实验，根据刺激与否及基因型的不同分为4组：WT对照组(WTc)、WT刺激组(WTs)、KO无刺激组(KOc)、KO刺激组(KOs)，每组小鼠4只，给予小鼠面部胡须规则的机械性刺激，连续刺激4周，于末次刺激后5小时灌注固定断头取脑，经快速Golgi法染色，然后进行振动切片。每只小鼠选取5张切片，用单盲法对每组切片进行随机编号镜下观察。每张切片选取2个管状区，每个管状区选取1个神经元，经全自动图像分析系统分别测量管状区中心方向上的树突棘形态、密度、长度，以及中心及周边两个方向上的树突与同心圆的交点数，对比分析树突和树突棘行为依赖性可塑性的改变。 结果：1.小鼠胡须行为观察：两种小鼠在小鼠胡须物体表面鉴别实验表现出明显的差异。在不同的平台间距离时，KO型小鼠在同一距离的达标天数均较WT型小鼠明显增加(P＜0.01)。 2.无胡须刺激时，KO组小鼠Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘形态分类中不成熟的C+D类树突棘比例较WT对照组增多，而成熟的F+G及H类树突棘比例减少(P均＜0.01)；胡须刺激后，KO刺激组Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘形态分类中C+D类的树突棘有明显减少，F+G类的树突棘比例增加(P均＜0.01)，与WT刺激组同类的树突棘形态相比无显著性差异(P＞0.05)。(树突棘形态分类方法见论文材料与方法部分。) 3.KO无刺激组小鼠Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘长度较WT对照组变长(P＜0.01)；胡须刺激后KO刺激组Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘长度较KO无刺激组明显变短(P＜0.01)；而WT刺激组Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘长度与WT对照组相比变短但不显著(P＞0.05)。 4.KO无刺激组小鼠Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘密度与WT对照组2相比未见显著性差异(P＞0.05)；胡须刺激后两种小鼠Barrelcortex区神经元中心朝向的树突棘密度均较其无刺激组明显增加(P＜0.01)。 5.KO无刺激组小鼠Barrelcortex区神经元中心方向的树突与同心圆交点数较WT对照组小鼠未见显著性差异(P＞0.05)；胡须刺激后两种小鼠Barrelcortex区神经元中心方向的树突与同心圆交点数在20μm、40μm处均较其无刺激组增加，差异有显著性(P＜0.01)，而KO刺激组与WT刺激组之间相比则无明显差异(P＞0.05)。KO无刺激组小鼠Barrelcortex区神经元周边方向的树突与同心圆交点数较WT对照组小鼠在20μm、40μm、60μm处有明显增多，差异有显著性(P＜0.05)；胡须刺激后两组小鼠的树突与同心圆交点数相比，无显著差异(P＞0.05)。 小结：1.FMR1基因敲除小鼠的胡须行为存在异常，这种异常可能与脑内胡须感觉区神经元及其整合功能异常有关，并涉及学习记忆障碍、运动平衡障碍等相关异常。 2.FMR1基因敲除小鼠皮层感觉皮质管状区神经元存在树突棘及树突分支的异常，主要表现为树突棘长度增加，形态幼稚，密度无明显改变，管状区周边方向的树突分支增多；这些异常可能是胡须行为异常的基础。 3.FMRP表达缺失可能会导致FMR1基因敲除小鼠神经元树突棘及树突的行为学可塑性异常，胡须机械性刺激能部分逆转FMR1基因敲除小鼠皮层感觉皮质管状区神经元树突棘形态及树突分支的异常，表明存在脆性X综合征行为依赖性可塑性治疗意义。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

缩略词表

致谢

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