骨髓间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎的实验研究

摘要

目的： 溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)是一种原因不明的慢性非特异性结肠炎。其病情易复发，迁延不愈，可致严重并发症，已成为临床治疗的一个难题。本病在欧美等国家常见，近年来我国该病的发病率有明显增高趋势。其确切的病因和发病机制至今尚不清楚，认为与免疫系统失常、遗传易感性、环境及精神等多种因素密切相关。UC的治疗方法有多种，但均疗效不太令人满意。国外有应用干细胞移植治疗UC的个案报道，但尚缺乏系统的实验研究。本文旨在通过将同种异体大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植入大鼠UC模型后，探讨MSCs在大鼠UC模型结肠的定位情况；探讨移植后大鼠UC模型血清中的TNF-α、IL-10含量的变化。从动物实验角度探讨MSCs移植治疗UC的可行性。 材料与方法： 实验对象选择健康雌性的SD大鼠，约8周龄，体重约180-200g。随机分为A组为UC模型移植组，B组为UC模型对照组，C组为酒精对照组。A、B组均采用三硝基苯磺酸(TNBS)与酒精复合灌肠法建立UC模型，C组用酒精灌肠作为对照。用贴壁法以PBS-LDMEM培养基体外连续传代培养获得雄性SD大鼠的MSCs。A组造模后24小时，将0.4ml含2×106个MSCs的细胞悬浮液经尾静脉注射于UC模型的大鼠体内，同时B、C两组亦于灌肠后24小时注射0.4ml的生理盐水作为对照。分别于移植后第1天、第7天、第21天每组各取6、6、4只大鼠，手术切取远端结肠组织，用于制作病理切片(H-E染色)以观察其形态学变化，以及用于检测髓过氧化物酶(MPO)及提取DNA进行sry区段的检测。后者经PCR方法检测Y染色体的性别决定区段(sry)作为定位的标志，以确定MSCs的肠道定位情况。组织中的髓过氧化物酶活性用二甲氧基联苯胺-过氧化氢法检测。同时，经腹主动脉无菌采血，提取血清，用于检测血清中细胞因子IL-10和TNF-α的含量，以观察炎症因子的变化情况。 结果： 骨髓间充质干细胞于培养后24小时内贴壁，5～6天后，贴壁细胞体积增大呈梭形，有粗大突起伸出，部分细胞呈多角形，除部分细胞单个散在外，细胞多数聚集成集落；10～12天左右细胞铺成单层，排列成旋涡状，呈梭形或多角形，传代3次后即可移植。计数50mL体积培养瓶中细胞数目可达5×106个/瓶。经流式细胞仪检测CD44阳性率为89.58％，CD54阳性率为95.54％。 大鼠UC模型病理学上可见结肠粘膜的毛细血管扩张、充血、水肿，大量的淋巴细胞和中性粒细胞浸润。粘膜上皮细胞间有中性粒细胞浸润，腺体呈环状，腺细胞减少或消失，有隐窝脓肿及溃疡形成等一系列类似人UC的病理变化。A、B组的髓过氧化物酶(MPO)于第1天(A组：3.57±0.39，B组：3.33±0.56)、第7天(A组：2.38±0.59，B组：2.18±0.67)均较C组(第1天：1.15±0.39，第7天：0.84±0.40)明显升高(p＜.05)。在B组，与第1天(3.33±0.56)相比，第7天(2.18±0.67)和第21天(1.49±0.39)显著增高(p＜0.05)，而第7天、第21天之间无显著差异(P＞0.05)表明A、B两组炎症明显，并于第7天炎症达高峰，随后降低。 移植后sry检测显示：第1天，第7天和第21天阳性率分别为0％(0/6)，16.7％(1/6)和50.0％(3/6)，而对照组均阴性。 A、B组血清TNF-α(A组：52.8±16.7，B组：53.6±10.5)与IL-10含量(A组：161.6±23.0，B组：153.6±12.8)于第1天均较C组(C组TNF-α：28.6±7.8，IL-10：112.7±30.9)升高(p＜0.05)，但第7天(A组TNF-α：26.4±17.0，IL-10：133.7±10.3;B组TNF-α：36.8±12.7，IL-10：133.4±6.1)，第21天时(A组TNF-α：25.5±8.8，IL-10：133.7±13.2;B组TNF-α36.5±14.8，IL-10：128.9±31.2)均与C组(第7天TNF-α：30.4±10.2，IL-10：131.0±10.3;第21天TNF-α：31.3±9.4，IL-10：140.6±7.6)无差异(P＞0.05)，且A、B两组在各时期比较均无明显差异(P＞0.05)。 结论： 1.溃疡性结肠炎大鼠模型血清中TNF-α的水平和IL-10的水平均于炎症早期明显升高。2.同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植后其能在溃疡性结肠炎大鼠模型的肠道中定位。 3.骨髓间充质干细胞移植后溃疡性结肠炎大鼠模型血清中TNF-α的水平和IL-10的水平均无明显变化

目录

中英文对照缩略词表

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 溃疡性结肠炎的治疗现状及进展

致谢

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