氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌耐药的分子机制研究

摘要

目的：1.探讨抗菌药物MIC附近浓度的运用对细菌耐药的影响。 2.探讨诱导后耐药菌在应用外排泵抑制剂前后最低抑菌浓度(MIC)的差异；探讨氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌前后外排蛋白表达水平的差异。 3.探讨氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌前后膜孔蛋白表达水平的差异。 4.探讨氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌前后QRDR突变情况。 方法：1.取临床分离对喹诺酮敏感的肺炎克雷伯菌20株，分2组，每组10株，1组不加诱导作对照组，观察组则应用不同浓度梯度环丙沙星逐级诱导，最后成为耐药株，比较人工诱导耐药菌与敏感菌对FQL的MIC差异。 2.测定诱导耐药菌在应用外排泵抑制剂前后对FQL的最低抑菌浓度(MIC)的差异；用SDS-PAGE电泳观察诱导前后KPn外排泵膜蛋白表达。 3.用SDS-PAGE电泳观察诱导前后KPn膜孔蛋白表达。 4.对诱导前后KPn菌GyrA的QRDR进行聚合酶链反应(PCR)扩增和DNA序列的分析比较，并将诱导耐药菌与临床分离耐药株比较；用clustalx软件比较分析QRDR突变情况。 5.采用SPSS11.0统计软件的Idependent-SamplesTTest分析膜孔蛋白表达的差异。 结果：1.KPn敏感菌经环丙沙星MIC附近浓度、由低到高逐级诱导，最后成为耐药菌。 2.应用外排泵抑制剂利血平后，70％诱导耐药菌MIC有明显下降。诱导耐药菌外2排膜泵蛋白TolC表达增多，与诱导前敏感菌比较差异有显著性(P＜0.05)。 3.在被研究的10对诱导后耐药KPn菌中出现了3次第83位氨基酸突变。1次第106位氨基酸CAG(Gln)突变为CTG(Leu)，该突变为本次研究的新发现。 4.诱导耐药菌膜孔蛋白Porin表达减少，与诱导前敏感菌比较差异有显著性(P＜0.05)。 结论：1.KPn菌对FQL附近MIC药物浓度仍可耐药，本研究结果提示不足量应用抗菌药更易诱导耐药菌的产生，因此，治疗方面宜采用合理的最大剂量。 2.诱导耐药KPn菌包括QRDR突变、外排作用的增强、膜孔蛋白表达的减少三方面作用。 3.外排泵作用在肺炎克雷伯菌诱导耐药机制中起重要作用。外排泵抑制剂的应用对肺炎克雷伯菌耐药有一定的遏制作用。 4.突变多发生在gyrA基因的QRDR，以第83位氨基酸突变最多见，亦可能存在其他一些新的突变，如Gln106。

目录

英文缩写注释

前言

第一部分 环丙沙星体外诱导KPn敏感菌成耐药菌

第二部分 氟喹诺酮体外诱导KPn外排蛋白表达差异的研究

第三部分 氟喹诺酮体外诱导KPn膜孔蛋白表达差异的研究

第四部分 体外氟喹诺酮诱导KPn耐药菌与临床分离耐药株QRDR变异的差异研究

结论

参考文献

附图

综述： 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究进展

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