C反应蛋白对人血管内皮细胞晚期糖基化终产物受体表达的影响

摘要

[背景]：糖尿病血管并发症包括动脉粥样硬化和微循环功能损伤，是糖尿病患者致残和死亡的主要原因。病人心血管病的发生率明显高于一般人群，发病年龄明显提前，这被称为“加速型动脉粥样硬化”。加速型动脉粥样硬化的发生机制目前尚未完全阐明。研究表明：高度表达于糖尿病患者中的晚期糖基化终产物受体(ReceptorforAdvancedGlycationEnd-Products，RAGE)可能在导致内皮活化和炎症反应，因而在加速动脉粥样硬化进展中扮演重要角色。在体外实验中，RAGE对血管内皮细胞具有多种病理生理学效应，包括使内皮通透性增加、刺激内皮细胞过度表达黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)及促炎症介质如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生增多，从而加速动脉粥样硬化发生。也有资料表明在糖尿病形成的动脉粥样硬化斑块中和闭塞性血管局部均可见RAGE的表达明显升高。 C-反应蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)是人血清中常见的非抗体性蛋白质量，在正常人体中微量表达(约1μg/ml)。但是在一些感染、缺血和坏死等致病因素作用下，人体C-反应蛋白水平可升高100倍以上，故CRP通常作为独特的炎性标记物来检测炎症反应性疾病。临床实验证明：CRP在动脉粥样硬化及糖尿病患者体内均有不同程度的升高。近年来研究还发现：人体CRP水平的升高是动脉粥样硬化发生的独立危险因素，CRP还可以作为动脉粥样硬化中炎症活化因子，促进ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、内皮素(ET)水平的升高，导致内皮活化和单核巨噬细胞聚集。正常人体中CRP是以5个单体结合形式存在。但有文章认为，经过构型改变后单体CRP(MonomericCReactiveProtein，mCRP)才能与细胞表面受体结合，发挥其促炎症的作用。 由于CRP介导和RAGE介导的炎症下游因子相似，但两者是否同时参与促炎症介质的产生过程目前尚不清楚。我们利用体外培养的人血管内皮细胞，研究CRP是否存在对RAGE的诱导作用。 [方法]：1.人隐静脉内皮细胞的体外原代培养及传代培养；2.利用流式细胞技术及WesternBlot方法检测内皮细胞经CRP刺激后RAGE蛋白的表达；3.利用流式细胞技术检测CRP对RAGE与AGEs结合的影响；4.利用RT-PCR和Real-TimePCR方法检测内皮细胞经CRP刺激后RAGE的表达及CRP对RAGE转录后的调节；5.利用RNA干扰技术阻断内皮细胞RAGEmRNA的生成，构建RAGE表达缺失的细胞模型；6.利用ELISA方法检测CRP对RAGE表达缺失的细胞促MCP-1生成的作用。 [结果]：1.CRP增加内皮细胞RAGE蛋白表达(WesternBlot和Flowcytometry法)1)不同浓度CRP刺激24小时对RAGE蛋白表达的影响与对照组相比，加入CRP5μg/ml即可见RAGE蛋白表达量增加(P＜0.05)，在CRP25μg/ml时RAGE蛋白表达增加更为明显，CRP浓度为50μg/ml时RAGE蛋白表达量最大，随后在CRP浓度为100μg/ml时表达量略有下降。2)50μg/mlCRP作用不同时间对RAGE蛋白表达的影响CRP组RAGE蛋白的量均高于对照组(P＜0.05)。RAGE蛋白表达量在培养6小时即有增加，并在24～48小时达到最大值。 2.CRP对RAGE与其配体AGEs结合能力的影响Flowcytometry检测表明：与对照组相比，50μg/mlCRP作用内皮细胞24小时，能明显增加细胞表面RAGE与AGEs的结合能力(P＜0.05)。 3.CRP上调RAGEmRNA表达(RT-PCR法)1)不同浓度CRP刺激12小时对RAGEmRNA表达的影响加入CRP5μg/ml即可见RAGEmRNA表达量有所增加，CRP25μg/mlRAGEmRNA表达增加有显著性，CRP浓度为50μg/ml时增加RAGEmRNA表达最大，随后在浓度为100μg/ml时表达量略有下降。2)CRP作用不同时间对RAGEmRNA表达的影响将50μg/mlCRP加入内皮细胞培养不同时间(0、6、12、24、48小时)，发现CRP组中目标基因PCR产量均高于对照组(P＜0.05)。RAGEmRNA表达量在培养6小时即有增加，并在12小时达到峰值，CRP作用24与48小时RAGE表达较12小时有所下降，但仍较对照组明显增高。 4.CRP上调RAGEmRNA表达(Real-TimePCR法)1)CRP作用不同时间对RAGE蛋白表达的影响将50μg/mlCRP加入内皮细胞培养不同时间(0、6、12、24、48小时)，发现CRP组中目标基因表达明显增高(P＜0.01)。RAGEmRNA表达量在培养6小时即有增加，递增至24小时达到峰值，CRP作用48小时组RAGE表达虽较24小时组明显下降，但仍比对照组明显增高。2)不同浓度CRP刺激24小时对RAGEmRNA表达的影响加入CRP5ug/ml即可见RAGEmRNA表达量显著增加，25μg/mlCRP增加RAGEmRNA表达更为明显，CRP浓度为50μg/ml时增加RAGEmRNA表达最大，随后在浓度为100μg/ml时表达量稍有下降。 5.CRP提高RAGEmRNA在内皮细胞内的稳定性利用Actinomycin-D阻断细胞mRNA的生成，RT-PCR检测发现：对照组与50μg/mlCRP刺激6，12，24小时组相比无明显差别，mRNA下降程度相似；但与CRP刺激48小时组比，对照组RAGEmRNA则明显下降。 6.比较CRP与其单体mCRP对内皮细胞RAGE表达的影响将50μg/mlCRP及mCRP加入内皮细胞培养不同时间(0、6、24小时)，用流式细胞技术检测：与对照组相比，mCRP组亦在6和24小时显著升高目标蛋白RAGE的表达，但与对应时间的CRP组比较无明显差异(P＞0.05)。 7.RNA干扰RAGE表达对CRP及LPS诱导MCP-1水平的影响利用RAGE特异的siRNA成功构建RAGE缺失细胞模型。ELISA检测培养液MCP-1水平。实验发现：与空白对照组组相比，CRP(50μg/ml，24h)刺激组MCP-1水平明显升高(P＜0.01)，仅经过siRNA转染组MCP-1水平显著减低(P＜0.01)，而siRNA加CRP刺激组水平与对照组差异没有显著性(P＞0.05)；LPS(1ng/ml，24h)刺激组与siRNA加LPS刺激组可以看到MCP-1水平的升高(P＜0.05)，但该两组相互比较差异没有显著性(P＞0.05)。 [结论]：实验结果提示RAGE作为一种在放大因素而存在于动脉粥样硬化的炎症反应中。CRP可以从蛋白和mRNA水平促进RAGE的表达，在一定程度内呈浓度-时间效应；并增加其与配体结合的能力，通过RAGE信号轴放大炎症反应，从而加速动脉粥样硬化的进展。

目录

缩略语表

摘要

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综述 RAGE：加速糖尿病性动脉粥样硬化发病的中枢环节

致 谢