从虎杖中酶法提取白藜芦醇的工艺研究

摘要

以天然植物虎杖为原料提取白藜芦醇的生产工艺研究是当今生物制剂研发的重要课题之一。白藜芦醇在虎杖中以糖苷形式存在。在实际的提取生产过程当中，存在诸如：发酵效果不理想，白藜芦醇提取率较低，生产周期长等一系列问题。为了克服生产过程出现的不足与困难，本文对虎杖中白藜芦醇的提取工艺进行重点研究，同时还对提取物粗品中白藜芦醇的检测和分离开展了较系统的研究工作。
　　研究建立了HPLC定量检测白藜芦醇和白藜芦醇苷的方法，用Agilent，Eclipse XDB－C18反相色谱柱，以乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱。采用外标法建立白藜芦醇和白藜芦醇苷的标准加入工作曲线，白藜芦醇标准曲线拟合结果为：白藜芦醇苷标准曲线拟合结果为：检测结果线性拟合度较高，结果较精确。最后，利用 HPLC法测定了天然植物虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的初始含量，其中白藜芦醇质量含量为0.444％，白藜芦醇苷质量含量为2.076%。
　　虎杖中白藜芦醇提取工艺则采用直接酶解——醇提结合方法，通过单因素试验选择关键影响因素并进行响应面分析，确定了虎杖酶解的最优提取工艺为：200目的虎杖，在固液比为1:20（g:ml），酶解温度约42℃，NaAc-HAc缓冲溶液的pH值约为4.72，纤维素酶添加量为1:500(g酶:g虎杖原料)，恒温搅拌反应22h，反应后的固体残渣，用1:10（g:ml）量的甲醇溶剂重复提取4次，每次提取10min。对白藜芦醇的提取率影响顺序先后分别为：B.酶解温度>A.纤维素酶添加量>C.酶解pH值，其中酶解温度对模型影响最为显著。最后按虎杖干基质量计算，白藜芦醇的提取率为1.389%，白藜芦醇苷转化率为97.03%。
　　通过树脂筛选得出NKA-9树脂作为白藜芦醇的分离的最佳媒介，并且研究了虎杖提取物在树脂上的吸附脱附行为，优化了分离工艺，最后再经过氧化铝层析柱除杂，活性炭脱色，冷冻干燥等操作得到了高纯度白藜芦醇产品。白藜芦醇产品纯度达98.32%，分离精制回收率为92.61%。

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1 绪 论

1.1 虎杖简介

1.2 白藜芦醇的性质与药理作用

1.3 从虎杖中提取白藜芦醇（苷）的技术背景

1.3.1 传统溶剂提取法

1.3.2 碱提酸沉法

1.3.3 超声/微波辅助提取法

1.3.4 酶解提取法

1.3.5 CO2超临界萃取法

1.4 白藜芦醇的分析方法

1.4.1 薄层色谱法（TLC）

1.4.2 分光光度法（SP）

1.4.3 高效液相色谱法（HPLC）

1.5 研究课题的目的、意义及工作内容

1.5.1 目的与意义

1.5.2 研究工作内容

2 白藜芦醇的酶法提取工艺

2.1 概述

2.2 材料和试剂

2.2.1 材料

2.2.2 试剂

2.2.3 仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 定量检测方法选择

2.3.2 标准样制备

2.3.3 HPLC法标准曲线绘制

2.3.4 虎杖直接醇提实验

2.3.5 虎杖酶解单因素实验

2.3.6 虎杖酶解响应面分析实验

2.4 实验结果与分析

2.4.1 高效液相色谱检测条件

2.4.2 HPLC法标准曲线绘制

2.4.3 虎杖直接醇提实验

2.4.4 虎杖酶解单因素实验

2.4.5 虎杖酶解响应面分析实验

3 白藜芦醇分离精制工艺

3.1 概述

3.2 材料和试剂

3.2.1 材料

3.2.2 试剂

3.2.3 仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1 标准样配制

3.3.2 UV法标准曲线绘制

3.3.3 树脂预处理

3.3.4 供试样配制

3.3.5 树脂筛选实验

3.3.6 柱式动态实验

3.3.7氧化铝除杂精制工艺

3.3.8 活性炭脱色工艺

3.3 结果与分析

3.3.1 UV法标准曲线绘制

3.3.1树脂筛选

3.3.2 柱式动态试验

3.3.3 氧化铝柱除杂

3.3.4 活性炭脱色

4 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录