纳米金-卟啉/染料复合传感阵列的肺癌快速无创筛查方法研究

摘要

肺癌（Lung Cancer）是病发于支气管黏膜上皮的一种常见癌症。肺癌的发病率及致死率逐年上升，已然成为威胁人类生命健康的头号杀手。由于肺癌具有早期无明显症状、发现晚、疗效差、生存期短等特点且其发病机制目前尚不明确，只有早发现结合恰当的治疗方可有效提高患者的治愈率，可见广泛筛查是挽救众多肺癌高危人群生命的正确方法和关键环节。鉴于常规肺癌筛查方法具有创伤、耗时及昂贵等诸多弊端，难以适用于肺癌广泛筛查。Phillips等人研究表明人体呼气中存在肺癌相关标志物（挥发性有机化合物，以下简称VOCs），因此呼气检测可实现肺癌高危人群的无创、快速筛查。
　　由于呼气中复杂成分存在潜在干扰性，使得VOCs分子识别在本质上具有挑战性。用于VOCs检测的GC-MS等大型仪器，因操作复杂、价格昂贵等而受到诸多限制。过去十年间，各种导电聚合物或电化学阵列传感器也相继被研发，然而由于它们通常缺乏化学选择性，难以将类似化合物区分开。本研究构建了纳米金-卟啉/染料复合微阵列，用于呼气中肺癌标志物VOCs及临床呼气样本检测，这种基于交叉响应的半选择性传感阵列为肺癌高危人群的广泛筛查提供了思路。主要内容如下：
　　①VOCs明确：综述研究现状，以Phillips等人报道共性较高VOCs为参考依据，本研究共筛选出13种VOCs作为检测对象，主要分为四类——烷烃类化合物：正庚烷、正戊烷、十一烷、异戊二烯；醛酮类化合物：己醛、庚醛、丙酮；醇类化合物：甲醇、正丁醇；苯系物：苯、甲苯、1,2,4-三甲苯、苯乙烯。
　　②传感阵列构建：针对呼气中存在的痕量VOCs，研究设计了由13种卟啉类化合物（MTPP）和23种染料（Dyes）组成的6×6传感阵列用于VOCs检测。研究特别选择了三类敏感材料：含金属离子的响应材料，基于Lewis酸碱反应，可提供电子对或金属配位点，如四苯基金属卟啉等；pH指示剂，基于Bronsted-Lowry酸碱理论，可通过质子酸度或氢键作用产生响应，如溴酚红、溴甲酚紫、溴甲酚绿、甲基红、荧光素等；具有大量永久偶极染料，两性离子气致变色染料，可与局部极性分子发生气致变色反应，如尼罗红、分散橙等。由此可见，比起那些单靠物理吸附的方法，本文构建的可视化传感阵列具有更强“敏感材料-分析物”相互作用。
　　③传感阵列改进：由于MTPP在有氧条件下易发生光降解，从而降低检测稳定性，并缩短阵列保存时间，针对此缺陷本研究引入金纳米粒子（AuNPs）作为MTPP的光保护剂，并探索性分析了不同形貌AuNPs（金纳米球-AuNSs、金纳米棒-AuNRs、金纳米盘-AuNDs）对MTPP的保护作用，比较发现AuNSs的保护效果最佳：400nm入射光照射6h，AuNSs（2.5μM）对MTPP（1μM）可提供89％的光保护作用。
　　④VOCs检测：采用气质联用仪（GC-MS）检测VOCs及其混合物，分析结果显示混合物能得到较好分离且VOCs均能与数据库匹配出正确结果。采用三种改进的复合微阵列对筛选出VOCs及其混合物进行检测，检测结果显示AuNSs-MTPP/Dyes复合微阵列检测效果最佳：对己醛和苯等检测下限可达50ppb（n=5），检测信号放大约2倍；反应平衡时间缩短一半；同时阵列芯片的保存时间可延长14倍，RSD≦5%，可见AuNSs的引入显著提高了传感器的灵敏度、响应速度及稳定性等。研究还绘制了一系列VOCs特征性指纹图谱。通过比较筛选出稳定性好、灵敏度高且响应更快速的AuNSs-MTPP/Dyes复合阵列进行下一步临床样本检测。研究采用AuNSs-MTPP/Dyes复合微阵列对肺癌呼气模拟样本进行检测，模拟测试为临床样本的检测奠定了实验基础。
　　⑤临床样本检测：基于临床检查结果，采用可视化AuNSs-MTPP/Dyes复合微阵列对16例肺癌患者和54例健康者呼出气体进行检测，随机选取其中73%实验数据作为训练集，建立特征模型，其余27%作为测试集。研究采用指纹谱图、欧氏距离（ED）、聚类分析（HCA）、主成分析（PCA）及判别分析（DA）方法对测试数据进行分析，结果显示该方法灵敏度可达80.0%（n=4），特异性可达78.6%（n=4），准确率为78.9%，可见该方法对呼出气体具有较好的区分识别能力。
　　本研究引入AuNPs的主要贡献：1）保护效应，吸收入射光防止MTPP受光毒害；结合在MTPP中心氮原子上，防止光敏剂MTPP发生降解；2）协同效应，优越的光学特性使其与MTPP协同作用，以各种色调形象化地呈现化学反应程度；3）表面效应，带电表面和大的比表面积使其具有优异的吸附性能；4）光增强效应，光照使其形成表面等离激元，引起表面局域和近场增强，具有光增强效应。AuNPs优异的光学、吸附及保护性能，使得改进阵列能够获得更高灵敏度、更好稳定性和更快速响应效果。本研究优化了最佳实验条件：检测温度、阵列芯片放置时间等；探索性分析了VOCs识别机理：氢键作用、π–π共轭、金属配位、酸碱作用、气致变色及物理吸附等；为肺癌广泛筛查奠定了一定理论与实验基础。

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1 绪 论

1.1 肺癌及其呼气标志物

1.2 肺癌呼气标志物检测技术

1.3 可视化阵列传感器的研究进展

1.4 本论文的研究目的、主要研究内容、研究意义及创新点

2 不同表面结构的金纳米粒子的制备及与表征

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 金纳米粒子对卟啉类化合物光学性质的影响及结合机制

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 纳米金-卟啉/染料复合微阵列传感器的构建

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 AuNPs-MTPP/Dyes复合阵列传感材料的制备

4.4 AuNPs-MTPP/Dyes复合微阵列芯片的设计与构建

4.5 可视化传感器的总体结构

4.6计算方法

4.7 实验条件研究

4.8 本章小结

5 基于纳米金-卟啉/染料复合微阵列的VOCs检测研究

5.1 引言

5.2 材料与仪器

5.3 呼气中肺癌标志物VOCs的确定

5.4 GC-MS方法检测呼气中肺癌标志物VOCs

5.5 可视化传感检测呼气中肺癌标志物VOCs

5.6 敏感材料与VOCs的作用机制

5.7 本章小结

6 临床呼气样本检测与数据分析

6.1 引言

6.2 临床呼气样本采样及标定

6.3 本章小结

7 总结与展望

7.1 总结

7.2 展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目及获奖情况