SARS冠状病毒Spike蛋白预处理对细菌内毒素介导的肺细胞炎症反应的影响

摘要

研究背景和目的：
　　 严重急性呼吸综合征、H5N1禽流感、甲型H1N1流感等呼吸道病毒感染引起的呼吸系统重大传染病，具有传播迅速、人群普遍易感、高死亡率的特点，给人们的健康带来重大威胁。近年来的研究表明：
　　 呼吸道病毒感染致死的主要原因是病毒感染后继发的细菌感染。然而，呼吸道病毒感染继发细菌感染的机制至今尚不清楚。我们在前期的研究工作中发现：SARS-冠状病毒Spike蛋白可以引起宿主固有免疫应答的信号转导通路JAK-STAT的激活，导致肺部免疫病理损伤，gamma-干扰素可诱导的10Kda蛋白是介导免疫炎症的重要分子，JAK3抑制剂对损伤具有防治作用。在SARS死亡病人中继发条件致病菌感染是一个普遍现象。我们推测病毒感染引起的免疫损伤可能是导致细菌易感性的主要原因。本课题体外模拟人体病毒感染后继发细菌感染的过程，通过S蛋白预处理人支气管上皮细胞，观察清除病毒抗原蛋白条件下，继而的细菌内毒素作用对细胞炎症反应的影响，揭示其可能的机制与防治靶点。
　　 研究内容和方法：
　　 第一部分：SARS冠状病毒S蛋白作用于人支气管上皮细胞对JAK-STAT信号转导通路相关分子表达的影响
　　 1.应用昆虫－杆状病毒表达系统表达SARS冠状病毒S蛋白，并经镍亲和磁珠法纯化，western－blot鉴定纯化的S蛋白。
　　 2.用纯化的S蛋白作用于16HBE细胞，免疫荧光观察不同的作用时间JAK-STAT信号转导通路相关分子的变化。
　　 第二部分：SARS 冠状病毒S蛋白预处理16HBE细胞对LPS介导的炎症反应及JAK3抑制剂的影响
　　 1.16HBE细胞分为对照组（S-LPS-，A1组）、S蛋白预处理组(S+LPS-，A2组)、单独LPS处理组（S-LPS+，A3组）和S蛋白预处理-LPS处理组（S+LPS+，A4组）。
　　 S蛋白40ug/ml加入A2和A4组处理12h，PBS洗涤去除S蛋白，继而在A4组加入LPS20ug/ml，与此同时在A3 组添加同样浓度的LPS处理。各组细胞继续培养12h，收集细胞培养上清，液相芯片技术检测细胞因子和趋化因子的变化，观察S蛋白预处理细胞对后续LPS处理产生细胞因子和趋化因子的影响。
　　 2.按上一步的分组处理后，将新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMCs）加入趋化小室上室，15min后显微镜下随机选取15个视野进行细胞计数，观察不同组别产生的趋化因子对PBMCs的趋化作用。
　　 3.将A1～A4组细胞上清分别以三分之一体积与三分之二体积的无血清1640培养基混合后，与PBMCs共孵育12h，PBS洗涤后以含5％胎牛血清的1640培养基继续培养12h，收集上清进行液相芯片技术检测，观察不同组别处理对PBMCs产生细胞因子和趋化因子的影响。
　　 4.将16HBE细胞分为对照组（C1组）、S蛋白预处理-LPS处理组（C2组）、S蛋白＋抑制剂预处理-LPS处理组（C3组），其中JAK3抑制剂为760nM，随S蛋白40ug/ml一起加入，作用于细胞12h后PBS洗涤去除，LPS用法及用量同前，收集细胞上清，液相芯片技术检测不同组别细胞因子及趋化因子的变化，观察JAK3抑制剂对S蛋白预处理后LPS介导的肺上皮细胞释放细胞因子和趋化因子的作用。
　　 5.将C1～C3组细胞上清分别以三分之一体积与三分之二体积的无血清1640培养基混合后，与PBMCs共孵育12h，PBS洗涤后以含5％胎牛血清的1640培养基继续培养12h，收集上清进行液相芯片技术检测，观察不同组别处理对PBMCs产生细胞因子和趋化因子的影响。
　　 结果：
　　 第一部分：SARS冠状病毒S蛋白作用于16HBE细胞对JAK-STAT信号转导通路相关分子表达的影响
　　 1．应用昆虫－杆状病毒表达系统表达并经镍亲和磁珠法纯化的S蛋白，经western－blot鉴定为SARS 冠状病毒S蛋白。
　　 2.免疫荧光发现S蛋白作用于16HBE细胞可引起JAK-STAT通路JAK2、JAK3、STAT1、STAT5等分子的激活；STAT1、STAT5阳性表达细胞数在S蛋白作用后30min、45min、1h较未加S蛋白组明显增多，阳染细胞免疫荧光由胞浆向胞核聚集，以45min时最为显著；JAK2、JAK3分子阳性表达细胞数量在S蛋白处理后15min、30min亦较未处理组明显增多。
　　 第二部分：SARS冠状病毒S蛋白预处理16HBE细胞对LPS介导的炎症反应及JAK3抑制剂的影响
　　 1.液相芯片检测发现S 蛋白预处理组(S+LPS-，A2组)、单纯LPS处理组（S-LPS+，A3 组）释放IL-6、IL-8因子的水平较对照组（S-LPS-，A1组）明显升高：A1组（8.23±1.57；9.66±1.53pg/ml）、A2 组（87.17±7.8；22.25±0.44pg/ml）、A3组（63.16±1.07；43.82±4.38pg/ml），P值均<0.01；IP-10、RANTES因子释放在A2组较A1组明显升高：A1组（8.07±1.79；0.99±0.1pg/ml）、A2组（418.59±76.63；158.1±23.37 pg/ml），P值<0.01；S蛋白预处理-LPS 处理组（S+LPS+，A4组）上述因子的释放水平（依次为417.64±30.43；128.75±6.55；1305.45±35.17；187.05±18.46pg/ml）较单纯S蛋白预处理组和LPS处理组明显增高，P<0.01。
　　 2.S蛋白预处理组（50.66±13.93 PBMCs/视野）、LPS处理组（44±17.1PBMCs/视野）对PBMCs的趋化作用较对照组（3.2±4.81 PBMCs/视野）明显增强，且S蛋白预处理-LPS 处理组（77.46±8.69 PBMCs/视野）比单纯S 蛋白预处理组和LPS处理组的趋化作用更显著，P<0.01。
　　 3.液相芯片检测发现：S 蛋白预处理气道上皮细胞（A2 组）培养上清掺入较正常气道上皮细胞（A1 组）上清掺入培养的PBMCs 释放IFN-γ、MIP-1α、TNF-α等因子的水平明显增高：正常气道上皮细胞上清掺入组（IFN：21.33±11.31 pg/ml；MIP-1α：检测不到；TNF-α：22.3±1.91 pg/ml）、S 蛋白预处理气道上皮细胞上清掺入组（57±26.09；171.18±0.2；29.8±4.76pg/ml），P 均<0.05；而S 蛋白预处理-LPS 处理气道上皮上清掺入组PBMCs上述因子的释放水平（102.4±6.4；223.15±20.86；65.5±5.39pg/ml）较单纯S 蛋白预处理气道上皮上清掺入组明显增高，P<0.05；PBMCs 释放IP-10在S蛋白预处理气道上皮细胞培养上清掺入组（639.8±62.5pg/ml）较正常气道上皮细胞上清掺入组（检测不到）明显增高，P<0.01，但与S蛋白预处理-LPS处理气道上皮上清掺入组（668.6±86.88 pg/ml）相比，两组间无统计学差异。
　　 4.液相芯片检测发现S蛋白＋抑制剂预处理-LPS处理组较S蛋白预处理-LPS处理组IL-8、IP-10、rantes等因子释放水平明显降低：S蛋白＋抑制剂预处理-LPS处理组（71.72±3.2；713.86±27.9；77.94±1.53pg/ml）、S蛋白预处理-LPS处理组（128.75±6.55；1305.45±35.17；187.05±18.46pg/ml），P<0.01。
　　 5.液相芯片检测发现S 蛋白＋抑制剂预处理-LPS 处理组细胞上清掺入组较S 蛋白预处理-LPS 处理组PBMCs 释放IFN-γ的水平降低，分别为84.50±9.97 pg/ml、102.40±6.4 pg/ml，P<0.05。
　　 结论：
　　 1.SARS冠状病毒S蛋白预处理促进了细菌内毒素LPS介导的气道上皮炎症反应。
　　 2.S蛋白刺激过的气道上皮细胞能够促进外周血单个核免疫细胞的趋化，增加免疫细胞释放炎症因子的能力，并且显著增强了免疫细胞对少量细菌内毒素的炎症反应。
　　 3.SARS冠状病毒S蛋白诱导气道上皮细胞释放IP-10是介导肺内对细菌内毒素炎症反应性增高的关键因子，早期应用选择性JAK3抑制剂有可能在防治病毒感染后继发细菌感染中具有重要的应用前景。