早产儿与足月儿脐血间充质干细胞体外分离、培养及鉴定

摘要

[目的]观察分析早产儿与足月儿脐血间充质干细胞分离培养成功率,并研究其相关生物学特性和诱导分化潜能，寻求脐血间充质干细胞获取的最佳途径，为其进一步实验研究提供理论依据。 [方法]无菌条件下共取52份脐血，其中32份为足月儿脐血，20份为早产儿脐血（孕周32～36周），枸橼酸钠抗凝。取12份足月儿脐血，采用Ficoll淋巴细胞分离分离液密度梯度离心获取单核细胞（MNCs），同等接种密度下对比DMEM/F12培养基和MesencultTM培养基对脐血间充质干细胞培养成功率的影响；取20份足月儿脐血，密度梯度离心法获取MNCs，采用MesencultTM培养基，分别以1×106/ml，1×107/ml密度接种，对比两种接种密度对脐血间充质干细胞培养成功率的影响；取20份早产儿脐血，以1×107/ml 密度接种于MesencultTM培养基，对比早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率，并研究其各自生物学特性及诱导分化潜能。通过倒置显微镜观察其形态、生长增殖情况并描绘细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞表面标记，包括CD29、CD44、CD105、CD34、CD45；分别用成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞完全培养基进行诱导分化，通过茜红素染色检测间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力，油红O染色检测其向脂肪细胞分化能力，阿利新蓝染色检测其向软骨细胞分化能力。采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析。 [结果] 1.采用MesencultTM培养基和DMEM/F12培养基，1×107/ml接种密度和1×106/ml接种密度培养脐血间充质干细胞成功率的比较 采用MesencultTM和DMEM/F12培养基，其他条件等同的情况下，间充质干细胞培养成功率分别为50.00%（6/12）和8.33%（1/12），差异有统计学意义（P<0.05）；采用1×107/ml和1×106/ml接种密度，其他条件等同的情况下，间充质干细胞培养成功率分别为55.00%（11/20）和20.00%（4/20），差异有统计学意义（P<0.05）。 2.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率的比较 采用MesencultTM培养基及1×107/ml接种密度，其他条件相同，早产儿与足月儿脐血间充质干细胞培养成功率分别为85.00%（17/20）和55.00%（11/20），差异有统计学意义（P<0.05）。 3.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞生物学特性的比较 3.1早产儿与足月儿脐血间充质干细胞原代培养时间分别为（19.65±1.69）d和（28.36±1.36）d，差异有统计学意义（P<0.05）；P4代早产儿与足月儿脐血MSCs传代培养时间分别为（14.94±1.75）d和（19.27±2.10）d，差异有统计学意义（P<0.05）。 3.2流式细胞仪检测显示，早产儿与足月儿脐血MSCs均表达典型间充质干细胞标记CD29、CD44和CD105，均不表达造血干细胞标记CD34和CD45。 4.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞诱导分化潜能的比较 早产儿与足月儿脐血间充质干细胞成骨细胞诱导2周行茜素红染色均可见胞浆中有大量红色钙化基质沉积；成脂肪细胞诱导3周时行油红O染色均可见胞质中的脂滴被染成红色；成软骨细胞诱导3周时行阿利新蓝染色均可见细胞微团中有淡蓝色酸性蛋白多糖。早产儿与足月儿脐血间充质干细胞均具有向成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞分化潜能。 [结论] 1.早产儿与足月儿脐血中均存在间充质干细胞，并可在体外分离、纯化与扩增。 2.采用MesencultTM培养基和1×107/ml接种密度更有利于提高脐血间充质干细胞的培养成功率。 3.早产儿较足月儿脐血间充质干细胞培养成功率更高，原代和传代培养时间更短。 4.早产儿与足月儿脐血间充质干细胞均可在体外诱导分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞。

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讨 论

结 论

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综述 间充质干细胞治疗肺部疾病的研究进展

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