Clostridium absonum 7α-羟基类固醇脱氢酶辅酶结合区关键残基的功能研究

摘要

羟基类固醇脱氢酶（Hydroxysteroiddehydrogenase，HSDH）在胆汁酸类物质转化、甾体激素转化、胆固醇代谢、非甾体类醛、酮和醌羰基还原等过程中发挥着重要作用，同时，在工业生物催化方面也具有较大的应用潜力。本文以Clostridiumabsonum7α-HSDH（CA7α-HSDH）为研究对象，利用基因工程手段对CA7α-HSDH的辅酶结合位点进行改造，进一步应用分子动力学模拟分析酶与辅酶的作用细节，阐明CA7α-HSDH辅酶结合区关键残基的功能。
　　主要研究内容和结果如下：
　　（1）在GST标签融合表达的基础上，本文进一步探索了CA7α-HSDH关于pTWIN1载体的表达，成功构建了CA7α-HSDH/pTWIN1表达系统，获取了有良好活性的CA7α-HSDH，该表达方式的构建为降低CA7α-HSDH的获取成本，推动工业应用提供了一定基础。
　　（2）通过对三维结构分析，运用定点突变技术，对CA7α-HSDH的辅酶结合位点进行改造，成功获得了7个突变体T15A、R16A、R38A、R194A、R16A/R194A、R38A/R194A、T15A/R16A/R194A。酶促动力学研究显示，①成功获得了活性提高的R16A和R194A突变体，相比于野生型酶活性分别提高1.8倍和4.8倍。二者催化常数（kcat）和米氏常数（Km）均增大，R16A的催化效率（kcat/Km）下降了16.2％，而R194A的催化效率（kcat/Km）增大3倍。②T15A、R16A/R194A和T15A/R16A/R194A三个突变体同野生型酶相比，酶活性分别下降了26.8%、55.2%、75.9%。三者催化常数（kcat）降低，米氏常数（Km）增大，催化效率（kcat/Km）分别下降了81.8%、43.4%、84.6%。③R38A、R38A/R194A两个突变体未检测到活性，初步推测R38的作用较为关键。④从酶促动力学参数发现，保持功能的突变体Km和单点突变体的kcat均增大，推测T15、R16、R194的作用体现在酶与辅酶间亲和力和催化速度方面，相应的，T15和R194分别在维持亲和力和转化底物速度方面有较为突出的贡献。
　　（3）运用MD模拟技术，对上述突变体与辅酶作用的细节进行了研究。①结合自由能计算结果显示，与野生型相比，七个突变体与NADP+的结合自由能显著上升，这与酶促动力学实验测得的结果——突变体酶对NADP+的亲和力下降相符。②对R38A和R38A/R194A突变体分析发现，阳离子-π作用消失，表明突变体与辅酶的作用模式的改变破坏了NADPH与酶的结合，是突变体失去活性的原因；T15A、R16A、R194A、R16A/R194A、T15A/R16A/R194A这五个突变体未影响R38与辅酶的阳离子-π作用，因而仍然保持生物功能，与酶活实验结果相符，由此表明R38在CA7α-HSDH与辅酶II结合过程中具有关键作用。③将T15、R16、R194单点突变为丙氨酸后，小幅度减弱磷酸基团周围的正电量，T15、R16、R194与2位磷酸基团的氢键作用消失，由此表明，由T15、R16、R194介导的与磷酸基的氢键将直接影响酶与辅酶间亲和力，且亲和力具有一定的最适范围，在该范围内，适当的减弱亲和力有利于酶活、催化效率的提高；另外，将R194突变为丙氨酸后，R194与焦磷酸桥的氢键作用全部消失，导致焦磷酸桥柔性增大，处于反应中心的烟酰胺环运动/解离容易，整体反应速度加快，这与突变实验结果kcat值增加是相符的。④联合突变体R16A/R194A和T15A/R16A/R194A中，逐步提高正电量的减少程度，二者的催化效率随电荷量的减少而下降；另一方面，在这两个突变体中，发现S39与2位磷酸基间有极性作用存在，极有可能由于此氢键作用的参与，抵消了二者亲和力的下降程度。由此表明，在酶与辅酶结合的过程中，获得活性和催化效率较好的酶的前提是，保证周围的正电量和最适亲和力。

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中文摘要

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1 绪 论

1.1 课题研究背景

1.2 科学问题的提出及研究意义

1.3 研究内容

1.4 创新点

1.5 技术路线

2 CA 7α-HSDH的表达

2.1 引言

2.2 试验材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

3 CA 7α-HSDH辅酶结合关键残基的改造

3.1 引言

3.2 试验材料与仪器

3.3 试验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

4 CA 7α-HSDH及改造体的分子动力学模拟

4.1 引言

4.2 软件与设备

4.3 方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

5 全文结论及后续工作建议

5.1 全文主要结论

5.2 后续工作建议

致谢

参考文献

附录 攻读硕士学位期间参研的科研项目