PBDE-209对卵巢癌及仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响

摘要

多溴联苯醚（PBDEs）是一类含溴原子的芳香族化学物，常作为阻燃剂加到油漆、塑料、纺织、电子电器等产品中，目前已广泛应用于电子、电脑和泡沫等家具中。随着工业的发展，PBDEs在世界范围的需求不断增加，环境中的PBDEs的浓度也逐年增多。有资料显示，发达国家80%的电子垃圾进入中国、印度和巴基斯坦等国，其中中国占了90%，导致城市的户外空气中PBDEs浓度比农村空气中的10倍还多，在我国一些地区已形成了电子垃圾拆解集散地，原始的拆解手段(露天焚烧、烘烤和酸洗等)使PBDEs等持久性有毒污染物不断向周围释放，严重污染了当地环境，危害人体健康。由于PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用，能够通过食物链的转移，使生物受到毒害，最终导致对人体健康的危害。目前国内外对低溴联苯醚的相关毒性研究较多，而且结果较肯定，从大量动物实验中发现低溴类PBDEs具有肝肾毒性、生殖毒性、甲状腺毒性、神经发育毒性及潜在的致癌性等，因此，在欧盟及美国已禁止使用。而十溴联苯醚(decabrominated PBDE，PBDE-209或DeBDE)的毒性较低溴联苯醚类低，在美国及欧洲仍允许生产使用。我国不但是PBDEs的生产、使用和出口大国，而且还是接收电子垃圾的大国，其中PBDE-209的生产使用量最大，因此PBDE-209已成为我国重要的环境污染物。PBDE-209在环境中可以经光解、高温分解、生物及微生物降解等过程，转化成溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃及低溴代的联苯醚，更容易进入生物体,引起更强的毒性作用。但是，关于PBDE-209对机体是否存在危害仍有很多争议，研究证明PBDE-209具有神经发育毒性，免疫毒性，内分泌毒性以及致癌性； 动物试验证实PBDE-209有胎毒性，在孕期接触PBDE-209，能使雄性子鼠的生殖功能受损。近年来卵巢癌发病率呈持续上升趋势，是女性死亡率最高的生殖系统恶性肿瘤。目前卵巢癌病因尚未明确，但遗传因素和环境因素交互作用对卵巢癌的影响已引起人们的关注。PBDE-209可影响女性生殖系统及内分泌水平（激素），而环境中日益增高的PBDE-209浓度与女性生殖系统肿瘤发病率的升高目前并无相关的报道。因此，本课题从细胞水平出发，深入研究PBDE-209对体外培养的卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞和中国仓鼠卵巢上皮细胞株CHO细胞增殖的影响，观察低浓度PBDE-209暴露对癌细胞的增殖以及对细胞周期的影响，并初步探讨在这一过程中信号转导通路PKCα-ERK的磷酸化变化。本研究分为三个部分： 第一部分：PBDE-209对卵巢癌细胞和仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响。 目的：观察低浓度PBDE-209暴露引起OVCAR-3和CHO细胞形态学改变；MTT法检测细胞生物活性的变化；免疫荧光化学检测增殖细胞核抗原Ki67的表达变化；并用流式细胞术检测PBDE-209引起的细胞周期的分布变化。 方法：⑴贴壁培养OVCAR-3和CHO细胞，连续计数接种后0-7天的细胞数，描绘三种细胞株的细胞生长曲线，并计算细胞群体倍增时间。⑵取复苏后2-3代OVCAR-3和CHO细胞为实验细胞，饥饿同步化处理后，加入不同浓度PBDE-209作用不同时间（0-72h），观察细胞生长形态变化；并用MTT法测定细胞吸光度值，计算细胞增殖率变化。⑶用免疫荧光化学方法，观察不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后Ki67的表达变化。⑷用流式细胞术检测不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后，细胞周期分布变化。 结果：①卵巢癌细胞株和仓鼠卵巢上皮细胞株在生长形态和特点上完全不同：OVCAR-3细胞胞体接近椭圆形且形态不规则，呈集落样生长，接触性抑制较差，细胞群体倍增时间是36.74±1.29 h；而CHO细胞胞体呈梭形，亦呈集落样生长，耐饥饿能力差，细胞群体倍增时间是40.56±1.25h。②随着PBDE-209作用时间的延长以及浓度的升高，细胞增殖明显，细胞间隙变小。MTT检测发现，PBDE-209引起两种细胞株细胞增殖率变化呈现时间依赖和浓度依赖效应。50nM作用于OVCAR-3细胞24h即可以引起细胞的增殖；作用48h时使细胞增殖率增加1.53倍；而72h的暴露可以引起细胞1.75倍的增殖变化。而CHO细胞对PBDE-209的反应相对较轻，100nM PBDE-209作用48h和72h时细胞增殖率分别为1.47倍和1.51倍，弱于OVCAR-3细胞。③免疫荧光化学观察发现0-100nM PBDE-209作用72h时，可以引起Ki67阳性细胞百分率变化呈现浓度依赖效应。25nM、50nM和100nM PBDE-209作用于OVCAR-3细胞Ki67阳性细胞百分率分别为82.14%，85.42%和92.16%左右；而在CHO细胞中，PBDE-209引起的Ki67阳性细胞无明显的表达变化。④流式细胞术检测发现，PBDE-209作用于OVCAR-3细胞和CHO细胞72h后，使两种细胞株G0/G1期细胞比例下降而G2/M期（OVCAR-3细胞）和S期（CHO细胞）细胞比例升高；100nM PBDE-209使OVCAR-3细胞G0/G1期细胞比例由80.25%下降至72.35%，而G2/M期细胞比例由3.95%上升为11.90%；对于CHO细胞而言，100nM PBDE-209分别引起了G0/G1期细胞5.10%的下降以及S期细胞5.20%的升高。 结论：0-100nM PBDE-209暴露于OVCAR-3和CHO细胞0-72h时，使细胞增殖率和Ki67阳性细胞表达率升高；并引起G0/G1期细胞比例的下降和G2/M期（OVCAR-3细胞）和S期（CHO细胞）细胞比例的升高。 第二部分：PBDE-209引起OVCAR-3和CHO细胞中PKCα/ERK磷酸化水平的变化。 目的：观察PBDE-209在引起OVCAR-3和CHO细胞增殖过程中，PKCα和ERK信号转导通路的作用。 方法：用Western Blot方法观察0-100nM PBDE-209作用于细胞15min（浓度依赖实验）或者50nM PBDE-209作用0-120min（时间依赖实验），观察PBDE-209对OVCAR-3和CHO细胞中PKCα和ERK磷酸化水平的影响 结果：PBDE-209激活了PKCα和ERK的磷酸化，并呈现浓度依赖和时间依赖效应；但是在两个细胞株中，PKCα和ERK磷酸化达到峰值的时间和所需要的浓度有所差异。⑴浓度依赖实验：在OVCAR-3细胞中，随着浓度的升高，PKCα磷酸化水平增强，50nM时达到高峰，维持高水平至100nM；而ERK在25nM即可以出现明显的磷酸化，50nM时达到峰值，100nM时出现轻度下降，仍然高于阴性对照组；而在CHO细胞中，加入PBDE-209即可以激活P-PKC磷酸化，并且持续升高，50nM时达到高峰；ERK的磷酸化随着PBDE-209浓度的逐渐增高，其水平逐渐增强，在25nM时达到高峰，维持高水平直至100nM。⑵时间依赖实验：在OVCAR-3细胞中，作用30min即可以引起PKCα的磷酸化，60min时达到高峰，维持至120min；而作用15min即可以激活ERK的磷酸化，30min时达到峰值，并维持至120min；在CHO细胞中，作用5min时可以观察到PKCα磷酸化的激活，其水平逐渐增强，在120min时达到高峰；而当作用5min时同样观察到ERK磷酸化的激活，在60min时达到高峰。 结论：PBDE-209引起了OVCAR-3和CHO细胞PKCα和ERK的磷酸化，并且呈现时间依赖性和浓度依赖性。 第三部分：PKCα和ERK特异性抑制剂对PBDE-209引起的OVCAR-3和CHO细胞增殖的影响。 目的：观察PKCα特异性抑制剂G?6976或ERK抑制剂PD98059对PBDE-209引起的OVCAR-3和CHO细胞增殖的影响以及细胞凋亡率的变化；并观察G?6976和PD98059对PBDE-209引起的PKCα-ERK磷酸化表达的影响。 方法：⑴免疫荧光化学定性方法观察G?6976 或PD98059与PBDE-209联合作用72h后，Ki67表达变化；⑵流式细胞术定量观察G?6976 或PD98059与PBDE-209联合作用72h后细胞凋亡率的变化；⑶Western Blot观察G?6976 或PD98059预处理30min后，对PBDE-209引起的PKCα和ERK磷酸化的影响。 结果：①免疫荧光化学检测发现：与阴性对照组比较，G?6976 或PD98059可以使Ki67表达强度下降，其中G?6976的影响比PD98059更加明显；而PBDE-209与G?6976 或PD98059联合作用时，可以使Ki67表达强度增强，100nM的提升程度比50nM明显；但是均不能达到PBDE-209单独作用时Ki67的表达强度。②流式细胞术检测发现：G?6976引起OVCAR-3和CHO细胞的凋亡率分别为9.6%和17.5%，与阴性对照组比较均有统计学意义；而PD98059引起的两种细胞的凋亡率分别为3.25%和14.9%；当与PBDE-209联合作用时均可以使G?6976或PD98059引起的细胞凋亡率下降，100nM的下降效果比50nM更加明显，可分别使G?6976引起的细胞凋亡率在OVCAR-3和CHO细胞中下降5.25%和11.9%左右；而使PD98059引起的细胞凋亡率在OVCAR-3和CHO细胞中下降2.6%和12.1%。③Western Blot检测发现：单独PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞时，PKCα和ERK的磷酸化水平均增强，并具有浓度依赖性；而与阴性对照组比较，单独G?6976 或PD98059作用于OVCAR-3和CHO细胞，均可以使PKCα和ERK的磷酸化水平下降，其中G?6976的影响比PD98059更加明显；而PBDE-209与G?6976 或PD98059联合作用时，与单独PBDE-209处理组相比，PKCα和ERK的磷酸化水平亦明显下降。 结论：PBDE-209部分拮抗了G?6976和PD98059引起的OVCAR-3和CHO细胞的凋亡，进一步说明PBDE-209可以在一定程度上促进细胞的体外增殖；并且在这一过程中PKCα和ERK起到促进作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 PBDE-209 对卵巢癌细胞和仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响

第二部分 PBDE-209 引起OVCAR-3 和CHO 细胞中PKCa/ERK磷酸化水平的变化

第三部分 PKCa 和ERK 特异性抑制剂对PBDE-209 引起的OVCAR-3 和CHO 细胞增殖的影响

结 论

参考文献

附 图

综 述 多溴联苯醚PBDEs 与肿瘤关系的研究进展

研究生在读期间发表的文章

致 谢