基于纳米荧光探针的细菌芯片高效分析方法研究

摘要

面对国内外出现的多起严重威胁社会公共安全的食品和水源中致病菌中毒事件，以及现有致病菌检测技术存在的检测耗时长、检测设备庞大、操作繁杂等不足，本研究将微流控芯片技术和纳米技术结合，提出了高荧光强度、低背景干扰和高选择性纳米荧光探针标记的细菌荧光检测法和用于细菌高特异性、高灵敏、快速准确定量检测的细菌微流控芯片原位荧光检测法，为食品和水源中背景复杂、低含量的细菌（致病菌）的快速准确检测提供了新方法，对食品安全和环境卫生的评价具有重要研究价值和应用前景。
　　本文的主要研究工作及结果如下：
　　①吖啶橙荧光标记的细菌微流控芯片检测研究
　　设计并制作了集成7通道PDMS-Glass微流控芯片，并以大肠杆菌JM109为模板菌种，采用荧光量子产率高达0.92的吖啶橙标记，采用荧光光谱仪及微流控芯片微型荧光检测仪检测，大肠杆菌 JM109分别在102-106 cfu?mL-1和103-105 cfu?mL-浓度范围内存在良好的线性关系。最后，以超市冻猪肉为实际样本，对其国标法预处理后，同样AO标记通入自行设计的7通道PDMS-Glass微流控芯片荧光检测和分析，多组测试结果显示猪肉样本表面含菌总数在103-104 cfu?mL-1范围内，这与国标法-平板计数法测试结果基本一致，且检测时间从国标法的48 h缩短至不到4 h，极大的缩短了食源性致病菌检测时间，为食品安全快速检测提供了新思路，也为现场便携式细菌快速检测提供了新途径。
　　②自制壳层式AO@SiO2-NH2荧光纳米探针定量检测金黄色葡萄球菌
　　以吖啶橙（AO）为荧光内核材料，通过改进的反相微乳液法合成了呈规则球形大小均一，单分散性好，平均粒径为80 nm左右，表面带氨基且光稳定性较好的核壳结构AO@SiO2-NH2荧光纳米粒子。进而以金黄色葡萄球菌为实验样本，通过戊二醛分步交联将自制的 AO@SiO2-NH2作为高效低毒荧光标记探针对金黄葡萄球菌进行标记并进行荧光检测，金黄色葡萄球菌浓度对数与相应的荧光信号强度在103-107 cfu?mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为：IFL=69.188log(c)-161.28，线性相关系数达到0.9814，检出限达到5×102 cfu?mL-1。将该方法用于合成样本中金黄葡萄球菌细菌进行检测，回收率在96.5％-102.7%之间，RSD小于7%(n=5)。该方法具有简单直接、条件温和、检测时间短、灵敏度高和线性范围宽(跨越5个数量级)等优点。
　　③基于石墨烯-碳点 FRET效应和适配体特异性识别的鼠伤寒沙门氏菌微流控细菌芯片检测
　　利用石墨烯对适配体自动吸附及其荧光猝灭特性，提出特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的纳米荧光碳点-适配体（CDs-Apt）识别探针，设计制作了电沉积氧化石墨烯微流控阵列芯片，搭建了微流控芯片-LED诱导荧光原位检测分析微系统，针对鼠伤寒沙门氏菌建立了高灵敏性、高选择性和高通量的细菌检测模式和方法。实验首先采用改良的Hummers法和水热法分别制备得到水溶性的单层氧化石墨烯和纳米荧光碳点；通过 ITO导电玻璃上电沉积还原氧化石墨烯成功制备得到rGO/ITO微阵列芯片，并以芯片上沉淀的石墨烯为吸附基质和纳米淬灭剂，吸附识别探针CDs-Apt，构建的基于形成FRET原理的高灵敏荧光信号增强型微流控芯片传感平台，在CDs-Apt浓度为1μM，流速为1.0μL?min-1，淬灭时间和恢复时间分别为10 min和30 min的条件下，2 h内实现了鼠伤寒沙门氏菌的在线分析，且检测范围为102-106 cfu?mL-1，检出限为100 cfu?mL-1。通过检验CDs-Apt/GO复合物与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的作用，证明该芯片传感系统对于目标菌具有高选择性和高特异性，同时将该方法用于自来水等合成样本中鼠伤寒沙门氏菌的检测，回收率在96.5%-102.0%之间，RSD小于6%(n=7)。这种简单、集成的高通量检测芯片，可发展为复杂样品的自动化、集成化分析检测平台，推广到其它的生物分析体系中。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪 论

1.1 引言

1.2 国内外研究现状及发展动态分析

1.3 基于微流控芯片技术的食源性致病菌检测研究进展

1.4 细菌标记和检测的纳米荧光探针

1.5基于纳米荧光探针的微流控芯片细菌分析方法研究进展

1.6 研究意义及主要研究内容

2 吖啶橙荧光标记的细菌微流控芯片检测研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 自制壳层式AO@SiO2-NH2荧光纳米探针定量检测金黄色葡

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 基于氧化石墨烯-碳点FRET效应的鼠伤寒沙门氏菌微流控

4.1引言

4.2实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目