腺相关病毒介导IGF-1基因修复糖尿病大鼠膀胱功能的实验研究

摘要

目的:
　　研究重组腺相关病毒（rAAV）介导大鼠胰岛素样生长因子－1（IGF-1）基因对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠膀胱病变的治疗作用，为今后应用该病毒载体治疗糖尿病性膀胱(DCP)的临床试验奠定基础。
　　方法:
　　1、构建rAAV介导的IGF-1基因载体rAAV2/1-IGF-1，基因组颗粒滴度为1.3×1012v.g/ml。
　　2、应用STZ注射到雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔内诱导糖尿病大鼠的动物模型；设置正常对照组（n=10）和糖尿病组(n=10)，每两周测量一次体重和血糖水平，诱导糖尿病8周后应用代谢笼收集大鼠24小时尿量，随后进行充盈性膀胱测压检查获得尿流动力学参数以评估膀胱功能；应用常规HE染色方法观察膀胱逼尿肌病理形态学变化，探讨糖尿病大鼠膀胱结构与功能改变的病理基础。
　　3、设置正常对照组（CN组，n=8）；糖尿病模型组（DM组，n=8）；单纯转导rAAV2/1-IGF-1模型组（IGF-1组，n=8）；胰岛素治疗模型组（INS组，n=8）和转导rAAV2/1-IGF-1+胰岛素治疗模型组（IGF-1+INS组，n=8）。STZ诱导糖尿病8周后给予INS组和IGF-1+INS组每日皮下注射普通胰岛素6IU/只，IGF-1组和IGF-1+INS组肌肉注射rAAV2/1-IGF-1100μl/只。基因治疗6周后应用代谢笼收集各组大鼠24小时尿量，随后进行充盈性膀胱测压检查评估膀胱功能；采用常规HE染色观察各组大鼠膀胱病理形态学改变情况；应用免疫组织化学方法检测各组大鼠膀胱组织中IGF-1的表达强度。研究IGF-1基因对糖尿病大鼠膀胱病变的治疗作用。
　　结果:
　　1、与正常对照组相比，糖尿病组大鼠的平均血糖水平明显升高，体重明显降低，膀胱重量和24小时尿量明显增多（P<0.01）；充盈性膀胱测压检查结果显示，正常对照组和糖尿病组大鼠膀胱容量分别为(0.72±0.05)和(2.52±0.24)ml，两组间差异具有显著统计学意义（P<0.01）。两组大鼠剩余尿量分别为(0.05±0.01)和(0.43±0.06)ml，两组间差异具有显著统计学意义（P<0.01）。两组大鼠单次排尿量分别为(0.67±0.05)和(2.09±0.23)ml，两组间差异具有显著统计学意义（P<0.01）。两组大鼠排尿效率分别为(92.90±0.91)和(82.75±2.54)％，两组间差异具有显著统计学意义（P<0.01）。两组大鼠膀胱最大压力分别为(26.92±0.60)和(35.19±1.46)mmHg，两组间差异具有显著统计学意义（P<0.01）。糖尿病大鼠膀胱压力曲线出现多次小的压力波动，曲线不规则；常规HE染色可见糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌束排列紊乱，结构松散，肌束断裂。
　　2、与CN组相比，其他4组大鼠的平均血糖水平、膀胱重量和24小时尿量均明显增加，体重明显降低（P<0.01）。与DM组相比，IGF-1+INS组血糖明显降低，体重明显增加（P<0.01），膀胱重量减小（P<0.05）；充盈性膀胱测压检查结果显示CN组、DM组、IGF-1组、INS组和IGF-1+INS组膀胱容量分别为(0.75±0.03)，(3.31±0.41)，(2.88±0.29)，(2.90±0.16)和(1.96±0.57)ml，各组间差异具有统计学意义。单次排尿量分别为(0.70±0.03)，(2.52±0.29)，(2.24±0.18)，(2.30±0.14)和(1.70±0.51)ml，各组间差异具有统计学意义。剩余尿量分别为(0.05±0.01)，(0.79±0.14)，(0.64±0.11)，(0.59±0.06)和(0.26±0.06)ml，各组间差异具有统计学意义。排尿效率分别为(92.84±0.67)，(76.16±1.87)，(77.88±1.82)，(79.18±1.34)和(86.59±1.20)%，各组间差异具有统计学意义。膀胱最大压力分别为(27.20±1.00)，(35.64±1.74)，(34.48±1.73)，(34.31±1.06)和(34.72±1.71)mmHg，与DM组相比，3种治疗组差异均无统计学意义（P﹥0.05）。糖尿病大鼠膀胱压力曲线出现多次小的压力波动，曲线不规则，而3种治疗组均无此表现；常规HE染色可见CN组逼尿肌肌束排列整齐，肌束间结构紧密，间隙被结缔组织所充满，逼尿肌细胞大小形态均一。DM组膀胱逼尿肌肌束排列紊乱松散，肌束断裂，肌束间间隙明显增宽水肿，逼尿肌细胞萎缩，形态多样，淋巴细胞浸润，出现大量空泡变性，少量嗜酸变性，间质和胶原成分增多。IGF-1组逼尿肌肌束排列较整齐，结构紧密，间隙被结缔组织所填充，肌细胞空泡变性，少量淋巴细胞浸润。INS组可见逼尿肌肌束排列较整齐，结构较紧密，间隙被结缔组织所填充，少量空泡变性，肌细胞无萎缩。IGF-1+INS组逼尿肌肌束排列整齐，结构较紧密，间隙被结缔组织所填充，肌细胞无萎缩；免疫组织化学方法检测结果显示IGF-1在各组大鼠膀胱组织中均有阳性染色，且主要在膀胱逼尿肌细胞核表达，糖尿病大鼠膀胱组织IGF-1蛋白表达水平明显降低，与DM组相比，3种治疗组IGF-1蛋白表达均增强。
　　结论:
　　1. STZ诱导的糖尿病大鼠膀胱病变有与人类相似的病理和功能变化，可以作为研究DCP可靠的动物模型。
　　2.糖尿病大鼠膀胱组织IGF-1表达水平降低可能参与DCP的发生与发展。
　　3. rAAV2/1-IGF-1联合INS治疗可恢复糖尿病大鼠膀胱IGF-1蛋白表达水平，有效改善糖尿病大鼠的膀胱功能，其可能成为治疗DCP的一种合理方法。

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封面

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中文摘要

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英文缩写对照表

前 言

第一部分糖尿病大鼠膀胱结构和功能的改变

材料与方法

一、 材料

二、方法

结 果

1. 一般生理特征

2. 在体充盈性膀胱压力容积曲线

3. 光镜下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌结构表现

实验图表

讨 论

结 论

第二部分腺相关病毒介导IGF-1对糖尿病性膀胱病的治疗作用

材料与方法

一、材料

二、方法

结 果

1. 各组大鼠一般生理特征

2. 各组大鼠尿流动力学变化

3. 各组大鼠膀胱逼尿肌结构表现

4. 免疫组化检测IGF-1在膀胱组织中分布和水平的变化

实验图表

讨 论

结 论

参考文献

附 图

综 述

致谢

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