双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道粘膜Toll样受体2、4、9的表达影响

摘要

第一部分：双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎症状及肠道组织形态学影响
　　目的：研究双歧杆菌对新生鼠NEC模型中新生鼠的症状及肠道组织形态学影响。为在新生儿NEC治疗中使用双歧杆菌提供基础医学研究依据。
　　方法：
　　1、实验动物及分组：生后24小时内的36只新生鼠随机分为3组，每组12只，分别为：对照组、实验组、治疗组。对照组：不添加双歧杆菌，不进行NEC造模；实验组：进行NEC造模；治疗组：在进行NEC造模的同时添加双歧杆菌。
　　2、双歧杆菌的添加方法：在鼠配方奶中添加双歧杆菌，浓度为1*108cfu/ml,剂量为2次/日。
　　3、NEC造模方法：对进行造模的新生鼠进行人工喂养（6次/日），100％氮气缺氧90秒，4℃冷刺激10分钟，每日2次，连续满3天。
　　4、组织获取：建模结束后立即处死小鼠，在距盲肠0.5cm处，取远端回肠组织长度约0.5cm置于中性甲醛中固定，石蜡包埋制作病理切片。
　　5、实验检测指标：各组新生鼠实验前后的生长发育指标变化；新生鼠发生NEC的症状比较；NEC的发病率；H.E染色下肠道粘膜组织病理学评分。
　　6、统计学方法：采用统计学软件SPSS17.0进行统计，计量资料以平均值±标准差表示，各组间的比较采用方差分析，发生率比较采用Χ2检验，P<0.05具有统计学意义。
　　结果：
　　1.实验组体重增长低于对照组及治疗组（﹣0.28±0.05 VS2.16±0.28 VS0.56±0.07），三组间体重变化具有统计学意义（P<0.05）。实验组身长增长（0.35±0.14）低于另外两组，治疗组身长增长（0.71±0.02）低于对照组（1.23±0.06）而高于实验组，组间比较具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.实验组发生腹胀、便血等NEC临床症状发生率为50%，治疗组为20%，对照组则无NEC临床症状，实验组高于治疗组，两者间比较（χ2=2.00）具有统计学意义（P<0.05）。
　　3.实验组NEC发病率为58.33%，对照组为0%，治疗组为33.33%，治疗组发病率低于实验组，比较具有统计学差异。（P<0.05）三组肠道粘膜组织病理学平均评分分别为：实验组为1.75±0.75，治疗组为0.83±0.71，对照组为0。可见实验组的病理学损伤最严重（P<0.05）。
　　结论：
　　1.双歧杆菌可有效减轻新生鼠NEC造成的生长发育的迟缓。
　　2.使用双歧杆菌可减轻新生鼠NEC引起的腹胀，便血的症状。
　　3.添加双歧杆菌可减少新生鼠NEC的发病率，减轻其病理学变化的严重程度。
　　第二部分：双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道粘膜TLR2、TLR4、TLR9表达变化
　　（一）、双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道粘膜TLR2、TLR4、TLR9表达变化
　　目的：
　　通过荧光定量PCR方法检测添加双歧杆菌影响新生鼠坏死性小肠结肠炎的肠道粘黏膜组织中TLR2、TLR4、TLR9的表达量。为了解双歧杆菌对NEC的保护作用机制提供分子生物学研究。
　　方法：
　　使用第一部分实验各组获得的新生鼠的回盲部肠道组织进行荧光定量PCR检测组织中TLR2、TLR4、TLR9mRNA的表达量。采用统计学软件SPSS17.0进行统计，P<0.05具有统计学意义。
　　结果：
　　以对照组为参照，TLR2在实验组中的表达量是它的0.48倍，治疗组是它的2.49，治疗组表达量高于实验组；TLR4在实验组中表达量为对照组的3.48倍，治疗组中的表达量是其1.25倍，实验组表达量高于治疗组；TLR9表达量是对照组的0.47倍，治疗组中表达量是对照组的4.00倍，治疗组表达高于实验组。以上各组间比较有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　双歧杆菌减少NEC发病率及损伤可能与其能增加TLR2、TLR9表达，而降低TLR4的表达相关。
　　（二）、双歧杆菌在新生鼠坏死性小肠结肠炎病理损伤发生前对中肠道粘膜组织的TLR2、TLR4、TLR9表达影响
　　目的：
　　研究双歧杆菌在新生鼠坏死性小肠结肠炎病理损伤发生前对TLR2、TLR4、TLR9的表达量影响，为应用双歧杆菌预防NEC疾病的发病提供分子生物学依据。
　　方法：
　　45只出生24小时内的新生鼠随机分为三组，分别是对照组（n=15）、实验组（n=15）、治疗组（n=15）。各组处理方式与第一部分一致，分别于NEC造模过程中的24小时、48小时、72小时中每组处死5只新生鼠。用qRT-PCR方法测量获取肠道组织中TLR2、TLR4、TLR9的表达量。比较在不同时间段三中基因表达量的变化过程。采用统计学软件SPSS17.0进行统计，P<0.05具有统计学意义。
　　结果：
　　各组TLR2表达在24小时内的差异变化不大（P>0.05）；48小时后实验组的TLR2mRNA是对照组的1.07倍，治疗组是3.75倍，治疗组高于实验组（P<0.05）；72小时后可见治疗组TLR2表达量（对照组的5.97倍）高于实验组（对照组的0.72倍）。在24小时内TLR4的表达量在三组间无明显差异（P<0.05）；48小时后实验组表达量是对照组的3.45倍，而治疗组是对照组的1.33倍，实验组表达量高于另两组；在72小时后实验组TLR4表达量是对照组的8倍远高于治疗组（对照组的2.02倍），两者比较具有统计学意义。TLR9的表达在24小时内三组无明显差异（P>0.05）；48小时后治疗组增高，表达量是对照组的3.44倍高于另外两组的表达量，组间比较有显著统计学意义（P<0.05）；72小时后治疗组的TLR9表达量继续增高，（对照组的5.56倍）与实验组和对照组表达量相比有差异（P<0.05）。
　　结论：
　　添加双歧杆菌可预防NEC的发生，可能与其能在该病的病理损伤早期增加TLR2、TLR9表达,降低TLR4表达有关。

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中文摘要

英文摘要

前言

技术路线

第一部分 新生鼠坏死性小肠结肠炎模型的建立及双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道组织形态学影响

材料和方法

一、 材料

二、方法

结果

一、 各组新生鼠生长发育情况

二、各组新生鼠NEC发生率和肠道病理学评分：

讨论

第二部分 双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道粘膜细胞TLR2、TLR4、TLR9表达的影响

（一）双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎肠道粘膜组织TLR2、TLR4、TLR9的表达影响

材料和方法

一、材料

二、实验方法：

（二）双歧杆菌对新生鼠坏死性小肠结肠炎疾病早期进展中肠道粘膜组织的TLR2、TLR4、TLR9表达影响

一、材料：

二、实验方法：

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

在读期间取得的研究成果

致谢