骨桥蛋白过量表达和肝细胞癌侵袭潜能的关系及RNA干扰对其影响的基础和临床研究

摘要

原发性肝癌(hepatacellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)在全球恶性肿瘤发病率中占第5位。我国是肝癌大国，占死亡疾病谱第二位，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在多种恶性肿瘤（包括肝癌）过度表达，目前认为是肝癌转移的主要基因之一，OPN可能是临床检测肝癌术后复发转移的有价值指标之一。本课题先研究OPN在HCC的表达，接着研究RNA干扰对肝癌侵袭潜能的抑制作用。 第一部分： 原发性肝细胞癌患者中OPN的表达及意义研究 目的: 探讨HCC组织中OPN的表达及其与临床指标的关系。 方法: 应用实时荧光定量PCR检测21例HCC患者肝癌组织、癌旁组织的OPN mRNA表达，应用免疫组化方法检测肝癌组织和癌旁组织的OPN蛋白表达，探讨OPN基因mRNA及蛋白表达水平及其与临床的关系。 结果: HCC患者肿瘤组织、癌旁组织OPN的mRNA荧光定量PCR△CT值分别为（△CT值上升说明OPN mRNA表达下调）：3.43±1.65；5.42±2.04；5.45±1.52(P<0.05)，肝癌组织的△CT值比癌旁组织低，提示肿瘤组织OPN的mRNA表达高于癌旁组织。OPN蛋白评分在肿瘤组织和癌旁组织分别为：1.87±0.71；0.74±0.443(P<0.01)，肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织。OPN mRNA及蛋白质水平与HCC肿瘤大小、数目、肿瘤局部转移、生物学恶性程度等临床病理因素正相关(P<0.05)；OPN mRNA表达和远处转移差异没有显著性(P>0.05)，而和蛋白质水平表达的有显著性差异(P<0.05)；OPN mRNA及蛋白水平与血清AFP、CEA、CA-199、γ-GT、ALP水平及伴肝硬化没有显著性差异 (P>0.05)。 结论： 1．OPN mRNA和蛋白质在HCC中呈高表达。 2．OPN mRNA水平及蛋白水与肝癌的临床的一些重要病理因素正相关。 第二部分：骨桥蛋白在不同肝癌细胞株的表达及其与侵袭潜能的关系 目的： 研究不同转移潜能人肝癌细胞株的OPN表达情况及OPN浓度与与细胞侵袭潜能的关系。 方法： 应用半定量PCR、Westerm Blot方法检测不同转移潜能人肝癌细胞株（BLE 7402、SMMC-7721、HEP-G2等）OPN mRNA和蛋白的表达情况，观察上述肝癌细胞株在不同OPN培养浓度下的生存曲线、细胞周期、FN粘附能力、侵袭能力。 结果： HEP-G2、BLE 7402、SMMC-7721三种肝癌细胞株OPN mRNA的△CT值分别为：11.31，14.78，15.88；蛋白表达分别为：1.00，0.48，0.36。OPN mRNA和蛋白表达水平和肝癌细胞侵袭能力（包括生长能力、粘附能力、细胞侵袭转移能力等）呈正性相关(P<0.05)（侵袭能力：HEP-G2> BLE7402> SMMC-7721）。 结论：OPN能促进肝癌细胞株的侵袭潜能。 第三部分：应用RNA干扰肝癌细胞株骨桥蛋白表达对其侵袭潜能的影响 目的： 观察RNA干扰技术是否能抑制人肝癌细胞株内骨桥蛋白(OPN)的表达，及其细胞侵袭潜能的影响。 方法： 在第二部分实验基础上，应用化学合成OPN序列特异性双链RNA(OPNi-1)，转染人肝癌细胞株，用荧光定量PCR和Western Blot比较三种不同转移潜能的人肝癌细胞株（BLE 7402、SMMC-7721、HEP-G2）RNA干扰前后OPN的mRNA和蛋白表达情况。应用生存曲线、FN粘附和侵袭转移实验等检测RNA干扰后的肝癌细胞株侵袭能力RNA干扰前后的变化。 结果： RNA干扰后HEP-G2、BLE 7402、SMMC-7721细胞株OPN mRNA的△CT值分别从原来（第二部分实验）的11.31，14.78，15.88显著上升达12.37，16.80，17.68 (P<0.05)（提示OPN mRNA表达显著下降）；OPN蛋白表达从原来的1.00，0.48，0.36显著下降达0.60，0.36，0.26 (P<0.05)，相当于OPN的mRNA表达平均降低79％，蛋白表达下降81％。RNA干扰抑制三种肝癌细胞株的侵袭能力（包括生长曲线、细胞周期、粘附能力和细胞侵袭转移能力等）。 结论： RNA干扰通过抑制人肝癌细胞株内0PN基因而抑制其侵袭能力

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写及中英文对照

声明

前言

第一部分 OPN在HCC的表达及临床意义探讨

第二部分 骨桥蛋白在不同肝癌细胞株的表达及其与生长、侵袭潜能的关系

第三部分 应用RNA干扰抑制肝癌细胞株骨桥蛋白的表达及其与生长、侵袭潜能的关系

全文总结

参考文献

在读期间以第一作者发表论文

致谢