MicroRNA-148b促进放射诱导的凋亡增强非霍奇金淋巴瘤细胞的放射敏感性

摘要

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的异质性恶性肿瘤，根据其细胞来源分为B细胞型、T细胞型或NK细胞型。非霍奇金淋巴瘤的发病率在过去的四十年里明显增长，1970年至1990年间几乎翻倍。放射治疗是非霍奇金淋巴瘤的主要治疗手段之一。然而，约20％的疾病存在放射抗拒。因此，发展新的药物来降低放射抗拒，增强这些疾病的放射敏感性是非常重要的。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一组不编码蛋白质的短序列RNA，长约20-22个核苷酸。miRNA结合到其靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)位点，根据二者序列互补性抑制基因表达或降解靶基因。值得注意的是，越来越多的证据表明，miRNA参与调控细胞的放射敏感性。因此，miRNA可作为提高肿瘤放疗效果的新靶点。本研究的目的是探讨miRNA在调控非霍奇金淋巴瘤放射敏感性中的作用。
　　为了寻找调控非霍奇金淋巴瘤放射敏感性的miRNA，我们利用miRNA芯片检测非霍奇金淋巴瘤细胞株Raji细胞照射前后miRNA的表达差异。用集落形成实验检测Raji细胞的放射敏感性，发现临床常用的分割剂量2 Gy可以导致约50%的生长抑制。因此，给予Raji细胞2 Gy照射。照射后4小时提取RNA用miRNA芯片进行分析。结果发现，以P值<0.05为标准，20个miRNA照射后有差异表达，其中10个上调，10个下调。生物信息学分析表明，这些miRNA可能参与放射敏感性的调控。
　　在差异表达的miRNA中，miR-148b在照射后表达上调1.53倍。为了验证miR-148b照射后表达上调，使用非霍奇金淋巴瘤细胞株Raji细胞和RL细胞，在不同照射剂量和照射后时间点，通过荧光定量RT-PCR检测未照射组和照射组细胞中miR-148b表达水平的差异。结果表明，与未照射组细胞相比，照射组细胞中的miR-148b表达显著上调，与芯片的结果一致。
　　由于miR-148b照射后表达上调，我们假设其参与放射敏感性的调控。使用瞬时转染，我们利用miR-148b模拟剂(mimic)上调Raji细胞中miR-148b的表达，miR-148b抑制剂(inhibitor)下调Raji细胞中miRNA的表达。利用荧光显微镜，我们发现miRNA片段能够成功转染进入Raji细胞，转染效率＞80%。进一步用实时定量RT-PCR验证了miR-148b的上调和下调改变。
　　我们首先评估没有照射时，miR-148B在体外对Raji细胞生长的潜在影响。细胞增殖检测表明，miR-148b上调的Raji细胞同对照组相比，细胞生长速度明显降低。另一方面，miR-148b下调的Raji细胞细胞生长速度明显增加。接下来，我们将转染后的细胞进行照射。细胞增殖检测表明，照射2Gy或4Gy后，miR-148b上调组和对照组同未照射时相比，Raji细胞死亡增加。然而，miR-148b上调照射组同对照照射组相比，细胞死亡明显增加。这些结果支持假设，即miR-148b上调增加了Raji细胞的放射敏感性。为进一步证实miR-148b对放射敏感性的调控作用，我们使用miR-148b抑制剂，观察其能否诱导Raji细胞的放射抵抗。正如所预期的，我们发现miR-148b下调组同对照组相比，明显地对放射抗拒。这些结果表明，miR-148b对Raji细胞的放射敏感性有重要的调控作用。
　　为了进一步证实miR-148b可以增强Raji细胞的放射敏感性，我们进行了集落形成实验，并获得了类似的结果。转染miR-148b模拟剂的Raji细胞同对照组相比，照射后集落形成能力明显降低。相反地，转染miR-148b抑制剂的Raji细胞明显对放射抗拒。这些结果提供了进一步的证据表明，miR-148b增加了Raji细胞的放射敏感性。
　　接下来，我们探讨miR-148b对放射敏感性的影响是否是由于细胞周期的改变。流式细胞仪分析表明，miR-148b模拟剂和抑制剂不影响Raji细胞的细胞周期。转染24小时后，给予细胞0Gy、2Gy和4Gy的X射线照射，24 h后再进行分析。Raji细胞照射后表现出明显的剂量依赖性G2/M期阻滞。然而，同对照组相比，miR-148b模拟剂和抑制剂对Raji细胞照射后的细胞周期没有影响。
　　凋亡是恶性肿瘤细胞死亡的重要机制。我们探讨miR-148b是否通过诱导凋亡增强Raji细胞的放射敏感性。Raji细胞转染miR-148b模拟剂和抑制剂后，培养24小时，然后接受不同剂量的照射（0 Gy、2Gy和4Gy），24小时后进行Annexin V/PI双染色及流式细胞仪分析。未转染细胞也在照射后24小时分析。结果发现，在照射0 Gy、2Gy和4Gy时，miR-148b高表达组的凋亡细胞比例均明显比对照组和未转染组高(P<0.05)。这些数据表明，miR-148b可以促进放射诱导的Raji细胞凋亡。
　　生物信息学分析发现，抗凋亡基因Bcl-w可能是miR-148b的靶基因。进一步的研究表明，miR-148b可以抑制Raji细胞中Bcl-w基因mRNA和蛋白的表达。Bcl-w蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的重要一员，而Bcl-2家族蛋白在线粒体凋亡途径中发挥极为重要的调控作用。由此，我们提出假说，miR-148b抑制Bcl-w的表达，通过激活线粒体凋亡途径增强非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此假说有待进一步验证。
　　综上所述，我们的结果表明，miR-148b促进放射诱导的凋亡增强非霍奇金淋巴瘤细胞的放射敏感性。miR-148b可以被用来预测非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此外，改变miR-148b的表达可能是一种很有前途的治疗方案。然而，由于本研究主要集中在一个非霍奇金淋巴瘤细胞株，其结论应该在其他非霍奇金淋巴瘤细胞株、动物模型和人类进行验证。进一步的研究将推动我们更深入地了解miR-148b作为放射增敏剂的调控机制。

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技 术 路 线

第一部分 非霍奇金淋巴瘤细胞照射前后miRNA表达的变化及其功能预测

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 非霍奇金淋巴瘤细胞照射后miR-148b高表达的验证

材料与方法

结果

讨 论

第三部分 miR-148b增强非霍奇金淋巴瘤细胞的放射敏感性

材料与方法

结果

讨 论

第四部分 miR-148b增强放射敏感性的机制探讨

材料与方法

结果

讨 论

结论

参考文献

综 述

博士在读期间论文发表情况

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