BmBrC-Z介导家蚕免疫反应中20E对抗菌肽基因的激活

摘要

昆虫具有高效的先天性免疫系统以防御病原菌和寄生虫对自身的侵袭，体液免疫和细胞免疫为昆虫的两大免疫系统。抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是昆虫体液免疫反应中的重要效应因子，对于防御外来微生物入侵发挥着重要作用，可以直接抑制入侵微生物的增殖甚至直接将其杀死。已有的研究表明蜕皮激素20E（20-hydroxyecdysone,20E）对昆虫的先天性免疫反应有重要调控作用，当昆虫遭到病原菌入侵时，其机体的20E通过Immune Deficiency(IMD)信号通路上调AMPs等免疫相关基因的表达。但是，20E是怎样调控AMPs等免疫相关基因表达的分子机制仍不清楚。本文对转录因子BmBrC-Z是否在家蚕体液免疫反应中介导了20E诱导抗菌肽基因表达进行了探究，结果证实了BmBrC-Z确实介导了20E上调BmAMPs的表达。主要结果如下：
　　1、分别用大肠杆菌E.coli和黑胸败血芽孢杆菌B.bombyseptieus侵染家蚕五龄3天的幼虫，发现若在侵染前注射外源20E，家蚕的存活率显著升高，血液中菌落数量显著降低，表明蜕皮激素20E可以促进家蚕的免疫反应。
　　2、分别在体内和体外用20E诱导家蚕的脂肪体进行并检测7个BmAMPs基因的表达水平，发现20E上调BmAMPs基因的表达且不同基因之间差异显著，初步筛选出表达量最高的BmCeCE作为主要研究对象之一。
　　3、对11个BmAMPs基因启动子区域的转录因子结合位点进行预测，发现其中10个基因的启动子区域均存在BrC-Z元件，预测BmBrC-Z基因对BmAMPs基因具有调控作用；随后在BmNs细胞系中过表达BmBrC-Z基因并检测7个BmAMPs基因的表达水平，选出表达量最高的两个基因BmLeB3和BmGlv2，与BmCeCE一同作为进一步转录探究的抗菌肽基因。
　　4、构建家蚕BmCeCE、BmGlv2和BmLeB3启动子的荧光报告载体并在BmNs细胞系中用20E诱导，证实这3个BmAMPs基因的确受20E信号的上调，将BmLeB3启动子上的BrC-Z4调控元件突变后启动子活性显著降低且不再受20E调节，表明BrC-Z是20E诱导BmAMPs的重要调控元件。
　　5、在转染BmAMPs启动子报告基因的BmNs细胞系中将BmBrC-Z基因过表达后发现BmAMPs启动子活性显著升高，更直接地表明BmBrC-Z基因可以介导BmAMPs的表达。
　　综上所述，在家蚕的体液免疫系统中，20E信号可以上调抗菌肽基因BmCeCE、BmGlv2和BmLeB3的表达，BmBrC-Z转录因子介导了这一过程。

目录

缩略词表

1 绪 论

1.1 引言

1.2 文献综述

1.2.1昆虫的免疫

1.2.2抗菌肽（antimicrobial pepetides，AMPs）

1.2.3蜕皮激素（20-hydroxyecdysone, 20E）

1.2.4转录因子BrC（Broad-Complex）

1.2.5 20E与免疫的研究

1.3研究目的与意义

1.4 研究内容和技术路线

1.4.1研究内容

1.4.2技术路线

2材料与方法

2.1数据库与分析工具

2.2实验材料

2.3实验仪器

2.3.1基础仪器

2.3.2分子克隆相关仪器

2.3.3细胞实验相关仪器

2.4主要实验试剂及配制

2.4.1细菌侵染实验相关试剂

2.4.2分子克隆相关试剂

2.4.3细胞实验相关试剂

2.5实验方法与步骤

2.5.1细菌侵染实验相关实验步骤

2.5.2分子克隆相关实验步骤

2.5.3细胞相关实验步骤

3 结果与讨论

3.1 20E对家蚕免疫系统的调控

3.1.1 20E注射对家蚕免疫的影响

3.1.2 20E对家蚕脂肪体的诱导

3.1.3 BmAMPs启动子的转录因子结合位点（TFBS）的预测

3.1.4讨论

3.2家蚕BmBrC-Z基因的序列分析及BmAMPs基因的筛选

3.2.1家蚕BmBrC-Z基因的克隆与鉴定

3.2.2 家蚕BmBrC-Z基因四个亚型的氨基酸序列分析

3.2.3 BmBrC-Z基因真核表达质粒的构建

3.2.4 BmAMPs基因的选择

3.2.5讨论

3.3 20E激活BmAMPs启动子实验

3.3.1 BmAMPs启动子序列扩增引物的设计及荧光报告载体的构建

3.3.2 20E对BmAMPs启动子的诱导

3.3.3 BmLeB3突变基因的载体构建

3.3.4 20E对BmLeB3及BmLeB3突变基因的诱导

3.3.5 讨论

3.4 BmBrC-Z对BmAMPs基因的调控

3.4.1 BmBrC-Z基因的表达水平

3.4.2 BmAMPs与BmBrC-Z的共转染

3.4.3 BmBrC-Z4-28基因与BmBrC-Z共转染

3.4.4讨论

4 结论与展望

致谢

参考文献