NF-κB介导LPS对家蚕表皮蛋白基因BmCPT1的激活

摘要

昆虫表皮是隔离其自身内环境和外界复杂环境的一道重要屏障，也是其防御病原微生物的一道物理屏障，其主要成分是表皮蛋白和几丁质，因此表皮蛋白是一种重要的结构蛋白。昆虫的先天性免疫反应通过其模式识别受体特异性识别病原菌表面的某些靶标分子，区分出“自我”与“非我”成分，从而引发细胞免疫和体液免疫中的Toll信号途径和IMD信号通路及酚氧化酶原级联反应，产生相应的抗菌肽快速高效清除侵入的病原菌。NF-κB途径是Toll和IMD信号通路下游的调控路径。受逐级呈递的免疫信号活化，NF-κB家族的相关转录因子从抑制子上解离转运入核，结合到相关抗菌肽基因的启动子或增强子上，从而调控抗菌肽基因的表达。虽然家蚕（Bombyxmori）基因组框架序列在2004年已被测定，极大地推动了家蚕先天性免疫方面的研究，但是家蚕表皮蛋白受到免疫信号激活方面的研究仍然很少。
　　 本文通过在家蚕基因组数据库中检索得到家蚕表皮蛋白基因BmCPT1的序列，对其上游2002bp的启动子区域进行分子克隆，并利用TESS程序分析了该区域所含有的转录因子结合位点，发现BmCPT1基因的启动子内含有一个NF-κB结合位点。将该段序列连接到pGL3-basic载体上，将所获得pGL3-basic{pBmorCPT1-Luciferase}报告载体质粒转染到家蚕卵巢细胞BmN中，通过添加LPS和NF-κB信号阻断剂PDTC检测NF-κB能否激活BmCPT1基因的表达，并将检测到的荧光素酶表达活性数据进行显著性分析。结果证明BmCPT1基因的启动子能被LPS激活，而这种激活效应能被NF-κB信号阻断剂所抑制。为进一步验证荧光素酶报告系统结果的可靠性，我们将灭活后的大肠杆菌注射到5龄3天家蚕大造(p50)品系中，12h后提取诱导处理家蚕的脂肪体组织，从中得到脂肪体组织的核蛋白，根据BmCPT1基因中含有的NF-κB序列设计标记探针与突变探针，进行凝胶阻滞实验，证实家蚕的NF-κB转录因子BmRelish1能够结合到BmCPT1基因上游启动子的NF-κB结合位点上，说明LPS对BmCPT1基因的激活作用是通过NF-κB信号通路介导的。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫表皮蛋白的研究

1．1．1 昆虫表皮结构概述

1．1．2 昆虫表皮蛋白的功能与分类

1．2 昆虫的先天性免疫

1．2．1 昆虫细胞免疫

1．2．2 昆虫体液免疫

1．3 NF-κB概述

1．3．1 哺乳动物NF-κB途径的激活及其功能

1．3．2 果蝇中NF-κB途径与两条免疫通路的联系

1．3．3 家蚕中NF-κB相关分子研究情况

第二章 引言

2．1 研究背景

2．2 研究目的和意义

2．3 研究内容

2．4 技术路线

第三章 BmCPT1基因启动子荧光素酶报告载体的构建

3．1 材料和试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验仪器

3．1．4 溶液配制

3．1．5 生物信息学分析软件及相关网站

3．2 实验方法

3．2．1 家蚕BmCPT1基因的检索与引物设计

3．2．2 提取全蚕基因组

3．2．3 BmCPT1基因上游启动子的扩增

3．2．4 BmCPT1基因上游启动子的TA克隆与测序

3．2．5 BmCPT1基因上游启动子区域的转录因子结合位点的分析

3．2．6 荧光素酶报告系统载体的构建

3．3 实验结果

3．3．1 BmCPT1基因的分析及其上游启动子的TA克隆

3．3．2 BmCPT1荧光素酶报告载体的构建

3．4 讨论

第四章 BmCPT1基因响应免疫应答的细胞水平检测

4．1 材料和试剂

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 实验仪器

4．1．4 溶液配制

4．2 实验方法

4．2．1 Grace细胞培养基配制方法

4．2．2 细胞培养

4．2．3 提取高纯质粒

4．2．4 细胞转染与诱导

4．2．5 荧光素酶活性检测

4．3 实验结果

4．3．1 细胞转染体系优化与评价

4．3．2 免疫诱导后BmCPT1表达情况的荧光素酶活性检测

4．4 讨论

第五章 BmCPT1基因对NF-κB信号响应的验证

5．1 材料和试剂

5．1．1 生物材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 溶液配制

5．2 实验方法

5．2．1 大肠杆菌侵染正常家蚕的处理

5．2．2 用试剂盒抽提脂肪体核蛋白

5．2．3 探针设计、复性及检测

5．2．4 凝胶阻滞实验(gel-shift)

5．3 实验结果

5．3．1 凝胶阻滞实验探针设计

5．3．2 探针复性

5．3．3 凝胶阻滞实验

5．4 讨论

第六章 总结与讨论

参考文献

致谢