探究孕酮信号通路中HIF1对PPARγ和Edn2调控的分子机制

摘要

哺乳动物排卵在雌性生殖活动中发挥重要作用，孕酮是开启排卵的关键因子，其主要通过孕酮受体（Progesterone receptor,PGR）产生生理作用，用PGR抑制剂或将其条件性敲除后均降低卵母细胞的数目，甚至出现不育现象。此外，在该过程中，因脉管脱落和重塑而形成间断的低氧环境，也能影响排卵事件的正常进行。因此孕酮和低氧在排卵过程中至关重要。近年来通过大数据分析筛选出大量的PGR下游基因，但在已知的基因中却很少发现孕酮响应元件，如参与排卵过程中卵泡破裂和炎症反应的Edn2、PPARγ。这两个基因是否受PGR和低氧的调控，如何进行调控，以及如何协调参与排卵过程等，这些问题均有待阐明。
　　本实验以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN细胞为研究对象。1）用PMSG/hCG构建小鼠超排卵模型，联用PGR抑制剂RU486，收集小鼠卵泡中的颗粒细胞检测Edn2和PPARγ的mRNA的表达情况；2）在此基础上，辅以低氧模拟物CoCl2，探究低氧对颗粒细胞中Edn2和PPARγ的影响；3）进一步地，在KGN中超表达PGR、HIF1，以探究PGR、HIF1对Edn2和PPARγ的影响；4）为确认HIF1α的调控作用，采用CRISPR-Cas9技术在KGN细胞中构建HIF1α特异性敲除细胞系，辅以CoCl2处理，研究HIF1α介导PGR调控Edn2和PPARγ的机制；5）利用生物信息学分析孕酮调节信号中的网络节点。
　　结果发现：1）PPARγ和Edn2在PMSG处理48h，hCG处理11h后表达量显著性增加，但经RU486处理后表达量却显著下降；2）经CoCl2处理12h后显著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表达量；3）在KGN细胞中超表达HIF1各载体发现其主要通过HIF1α调控下游基因，且可通过低氧响应元件调控Edn2；4）缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA与蛋白本底水平在CoCl2刺激下均显著下降；而且超表达PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表达升高因HIF1α缺失后受阻；5）通过芯片数据分析探索并初步证实孕酮调节信号网络通路中存在4个关键网络节点，并发现9个潜在受PGR调控的基因。
　　总的来说，在排卵过程中PGR和低氧能够调节PPARγ、Edn2，且PGR对二者的调控依赖于HIF1α。孕酮调节信号网络通路分析为我们进一步了解在排卵过程中孕酮、低氧等因素如何通过基因调控来影响排卵进程奠定基础，而且也为理解哺乳动物排卵过程及相关疾病的发生机理提供一定的理论知识。

目录

英文缩略词对照表

1 绪 论

1.1 哺乳动物的排卵

1.2 PGR对排卵过程的影响

1.3低氧微环境对排卵的作用

1.4 Edn2对排卵过程的影响

1.5 PPARγ对排卵过程的影响

1.6研究目的与意义

2 PGR及低氧诱导因子1对排卵基因的调控

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法与步骤

2.4实验结果

2.5 讨论

2.6本章小结

3 HIF1α敲除细胞的构建及对排卵基因的影响

3.1 引言

3.2实验材料

3.3实验方法与步骤

3.4实验结果

3.5 讨论

3.6本章小结

4 PGR调控的分子机制

4.1引言

4.2实验材料

4.3实验方法与步骤

4.4实验结果

4.5 讨论

4.6本章小结

5 孕酮信号通路中靶基因的预测

5.1引言

5.2实验材料

5.3实验方法与步骤

5.4实验结果

5.5 讨论

5.6结论

6 全文讨论

7 后期展望

致谢

参考文献

附录

A.作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录：

B. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录：