复方天龙喘咳灵的黄酮成分提取及其对肺泡上皮细胞间充质转化的干预研究

摘要

研究背景与目的:
　　越来越多的临床实践表明：试图依靠单靶点的化学药物治疗复杂性慢性疾病是失败的。现代医药已开始尝试多靶点复方制剂治疗的新模式。中药复方通过有效部位群多靶点协同作用，是中医临床治疗的主要形式，特别是经典与经验方，经过长期临床实践证实是安全有效的。然而，它们的药效依托的现代分子机制尚不清楚。阐明中药验方的分子药理学机制及其物质基础是实现中药现代化必要的前提，也将为发展我国原创新药开辟一条重要途径。
　　天龙咳喘灵是广东省名中医邱志楠教授的经验方，由青天葵、款冬花、法半夏、熟附子、五味子等十味药材组成。临床长期用于治疗喘息型慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病以及哮喘等，疗效明确且无毒副反应。我们前期实验研究发现天龙喘咳灵能抑制 TGF-β1诱导的细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）信号活化，抑制气道上皮下成纤维细胞的α-SMA表达，从而有效防治慢性哮喘小鼠模型气道高反应性。由于天龙喘咳灵组方中的君药青天葵主要含黄酮类化合物，与ERK1/2信号调节有关，这提示天龙复方抗炎抗重塑作用可能与黄酮类化合物的作用关系密切，黄酮类化合物可能是其发挥主要药理机制的重要有效部位群。本研究中，我们成功建立了中药复方（天龙喘咳灵）总黄酮的提取方法与工艺流程，观察了提取物对体外模拟炎症微环境下损伤的上皮细胞向间充质转分化的干预作用。
　　研究内容和方法：
　　第一部分：天龙喘咳灵总黄酮的提取富集
　　1.建立复方天龙喘咳灵总黄酮含量检测方法。
　　2.采用L9(34)正交设计法筛选天龙复方总黄酮的最佳提取工艺：以乙醇-水提取物中总黄酮含量为评价指标,以乙醇浓度、提取时间、料液比及提取温度为考察因素。
　　3.在最佳提取工艺基础上，以总黄酮回收率和含量为考察指标，采用静态吸附分离法确定合适的大孔吸附树脂，采用动态吸附分离法确定上样浓度、上样速度、洗脱浓度、洗脱速度，确定最佳上样量和最佳洗脱容剂体积，优选出最佳富集工艺。
　　第二部分：天龙喘咳灵总黄酮对炎症细胞因子诱导的A549细胞EMT干预作用
　　1.采用MTT法检测天龙喘咳灵总黄酮对A549细胞增殖的影响，观察其剂量和时间依赖性。
　　2.模拟体内炎症微环境，通过添加细胞因子Cytomix（TGF-β1/IL-1β/IFN-γ）诱导体外培养的肺II型上皮细胞A549，显微镜下观察形态学变化，
　　3. Westernblot检测上皮细胞与间质细胞标志性蛋白，P-ERK1/2/ERK1/2的表达，研究天龙喘咳灵总黄酮对细胞因子Cytomix诱导的A549细胞EMT转化的影响。
　　4.采用Bio-Plex检测天龙喘咳灵总黄酮对Cytomix刺激A549细胞分泌IL-6的影响。结果：
　　第一部分：天龙喘咳灵总黄酮提取方法与工艺流程的建立
　　1.比较了紫外可见分光光度法、AlCl3比色法、Al(NO3)3比色法三种检测方法，样品和芦丁标准品在紫外可见分光光度法和AlCl3比色法中均没有共有吸收峰，而在Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法中于508nm处有共有吸收峰，考察该方法学的可行性表明：吸光度与浓度的线性关系好；显色15min-45min内吸光度稳定；精确度（RSD=0.287％）与重现性（2.083%）好；回收率均值为98.98%，RSD为1.65%。成功建立了采纳Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法测定天龙提取物黄酮含量的检测法。
　　2.正交试验极差分析发现相关因素的影响程度为：提取温度(C)＞料液比(B)＞乙醇浓度(A)＞回流时间(D)，方差分析发现提取温度和料液比对提取率有显著影响。对提取次数考察发现：第1次:第2次:第3次=4.86:1.00:0.34,确定提取次数：2次。综合考虑最优条件为12倍×60%C2H5OH×90℃×2次。
　　3.静态吸附分离法优选出 D312树脂，动态吸附分离法确定上样浓度（生药浓度为0.166g/mL）、上样速度（2BV/h）、洗脱浓度（50%C2H5OH）、洗脱速度（2BV/h），确定最佳上样量（10BV）和最佳洗脱容剂体积（4BV）
　　第二部分：天龙喘咳灵总黄酮对炎症细胞因子诱导的A549细胞EMT干预作用
　　1.复方天龙黄酮浓度在50微克/毫升以上时，24h、48h、72h各时间点均呈现对A549细胞增殖的抑制效应。
　　2.细胞因子Cytomix(TGF-β1/IL-1β/IFN-γ)与A549共培养48h后，显微镜下观察可见与未处理的A549细胞比较，经细胞因子Cytomix刺激后，大部分细胞呈现出梭状成纤维细胞形态，而在同时添加天龙喘咳灵总黄酮的A549细胞，上述形态改变明显逆转。Western blot显示天龙喘咳灵总黄酮对Cytomix诱导的E-cadherin表达下调有显著的恢复作用，同时阻断了Cytomix刺激导致的Fibronectin上调。此外,天龙喘咳灵总黄酮下调了Cytomix刺激诱导的HMGB1表达。
　　3. Western blot显示天龙喘咳灵总黄酮能够抑制ERK信号通路的磷酸化。
　　4.天龙喘咳灵总黄酮能抑制Cytomix刺激A549细胞IL-6的分泌。
　　结论：
　　1.建立了采纳Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法测定天龙提取物黄酮含量的方法。
　　2、利用水-乙醇浸提法对天龙喘咳灵总黄酮进行提取，采用正交试验法优化了天龙喘咳灵总黄酮的提取条件。
　　3、筛选确定了采纳D312型大孔吸附树脂富集，并建立了最佳富集方法。
　　通过以上研究，我们成功建立了复方天龙喘咳灵总黄酮的提取方法与工艺流程，对复方中的总黄酮进行了有效的提取与富集。
　　4、复方天龙喘咳灵总黄酮提取物能逆转细胞因子Cytomix（TGF-β1/IL-1β/IFN-γ）诱导的A549细胞EMT，并能抑制纤维化相关炎症因子IL-6的高分泌,提示在抗纤维化治疗上的应用前景。

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前 言

第一部分：复方天龙喘咳灵总黄酮的提取

材料和方法

结果

讨论

第二部分：天龙喘咳灵总黄酮对TGF-β1诱导的A549细胞EMT干预作用

材料与方法

结果

讨论

全文结论

附图

参考文献

综述

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