凹凸面基底上HUVEC生长行为的研究及其在血管生成模型构建中的应用

摘要

基底材料表面的拓扑形貌会显著影响细胞行为。了解细胞对基底表面拓扑结构产生的不同反应，对组织工程及再生医学等有重要指导意义。随着微加工技术的高速发展，已能实现微米级甚至是纳米级的特定图式的微拓扑结构的制备。其中研究较多的是微沟槽、微柱、微孔阵列等。由于横置的圆柱形表面的微拓扑结构比其它构型制备更为困难，现有的该类构型对细胞行为影响的研究相当有限。然而实际上在体内有大量圆柱形凹面和凸面结构存在，典型的如各种尺寸的血管。对其系统的研究能为体外血管生成相关研究以及血管支架的设计等提供新方向。本研究用负压成型法制备了圆柱形PDMS凹面和凸面基底结构，并将HUVEC脐静脉内皮细胞、A7r5平滑肌细胞、HFF-1成纤维细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞等4种与血管有一定相关性的细胞用于系统考察不同基底对细胞的影响。
　　与此同时，近些年发展起来的基于MEMS的微流控芯片逐渐成为体外细胞三维培养研究平台。且由于其能提供胞外基质三维支架、可控的生化因子浓度分布及力学加载等，其在体外组织模拟及体外微环境构建等方面都显著优于传统方法，特别是在体外血管生成模型的构建及血管生成微环境研究中展显出独特优势。本研究用一种新型的玻片成型法来方便、快捷的制备PDMS微流控芯片，且利用HUVEC在凹面结构上容易沿圆周环形生长的特性，将圆柱微孔阵列与芯片相结合进行了体外血管生成模型的构建，以期为血管生成相关的研究或药物筛选提供一个良好的平台。
　　本论文研究的主要内容为：
　　①制备了4种不同宽度的圆柱形凹面和凸面基底结构并利用MDA-MB-231细胞对基底结构进行初步评价。基于负压成型技术制备了25、50、100、200μm4种不同宽度的半圆柱形凹面和凸面PDMS基底。由于创新性的使用了双层PDMS薄膜来辅助基底结构的制备，使凹凸面基底表面光滑程度高。经相差显微镜和扫描电镜观测，凹面和凸面基底表面规整、清晰、没有棱角产生，其表面特性与平面PDMS基底基本一致。将MDA-MB-231细胞接种于不同尺寸的凹凸面基底上，发现在较大宽度的结构中，由于具有较小的曲率半径，细胞更容易受结构构型影响而极化生长。为获取更大的观测区域，选取了200μm宽度的凹凸面基底结构用于后续实验。
　　②4种不同细胞在凹凸面基底上极化生长行为的观测。将HUVEC、A7r5、HFF-1和MDA-MB-231细胞接种在凹凸面基底上，从极化细胞的比例和极化方向来定量分析细胞在凹凸基底不同区域中极化行为的差异。结果发现4种细胞在凹凸面基底上的极化比例均变高，HUVEC、A7r5和HFF-1细胞在凹面中比较容易沿圆周方向排布，而在凸面中细胞比较容易沿轴向排布。凹凸面基底上细胞的扫描电镜和免疫荧光实验结果与光镜观察基本一致。对平面细胞的F-actin免疫荧光观察发现F-actin在HUVEC、A7r5和HFF-1细胞中呈束状，而在MDA-MB-231细胞中呈环状，这或许是MDA-MB-231细胞在凹凸面上极化方向较随机的原因之一。另外，研究还发现HUVECs经肿瘤上清液诱导后，p-cofilin和整合素β1的表达变高，相应的其在凹凸面上的极化能力增强。
　　③HUVECs在凹凸面中的爬行行为的观测。利用延迟拍摄技术对HUVECs的爬行行为观察发现，细胞在凹面上爬行较快，且方向与极化方向一致。在平面上爬行速度次之，在凸面上速度最慢。进一步的分析发现，HUVECs会逐渐从平面区域迁移至凹面区域，且不喜欢往凸面上生长，因此我们认为HUVEC具有趋凹性和避凸性。
　　④细胞在凹凸面上粘附行为的有限元模拟。为模拟并分析细胞以及细胞-基底粘附层的力学特性，本文使用了标准线性固体模型和双线性粘结带模型对凹凸面基底上粘附生长的细胞进行了有限元建模。对细胞施加预应力后，观测不同凹凸面基底上细胞粘附层的应力分布差异。结果显示HUVEC、A7r5和MDA-MB-231细胞的模拟结果与实验观测基本一致，细胞粘附层外缘在凹面圆周方向会受到更大的来自基底的牵引力。通过对凹-平面、凸-平面基底上细胞粘附行为的模拟，也较好解释了HUVEC的趋凹性和避凸性。进一步的研究还发现了细胞瞬时弹性模量和粘附层弹性模量这两个力学参数以及凹凸面的曲率半径对细胞在凹凸面基底上粘附行为的影响。
　　⑤结合圆柱微孔阵列的微流控装置的制备。本研究采用玻片成型法方便、快捷的制备了一种五腔室PDMS微流控芯片。由于HUVEC在圆柱凹面中能沿圆周方向环形生长，我们在芯片相邻腔室间的纵立面上加入了圆柱微孔阵列组成的PDMS栅栏结构，以用于构建体外血管生成模型。在芯片中间灌注胶原后，使用FITC-葡聚糖表征芯片中可溶性因子的扩散行为。结果显示FITC-葡聚糖在相邻腔室间能形成良好的线性梯度。进一步用有限元方法模拟了VEGF在芯片中的扩散行为，结果与FITC-葡聚糖的实验结果基本一致。
　　⑥基于微流控芯片体外血管生成模型的构建。将HUVECs接种于微流控芯片中后，在中间腔室加入促血管生长因子VEGF，使细胞在VEGF诱导下向胶原中爬行和出芽生长。在利用CFDA-SE活细胞染料示踪后，通过共聚焦显微镜观察发现HUVECs会先沿微孔内壁环形生长，在胶原面形成环形细胞簇，然后向VEGF高浓度区域迁移并侵入3D胶原凝胶中形成出芽和管腔样结构。芯片中带微孔栅栏一侧的细胞在胶原中出芽长度显著大于对照组(不含微孔栅栏)，芽体间形成的网格状空隙数量也显著大于对照组，提示微孔栅栏组中的HUVECs能形成更长的芽体以及交互更优的管腔样结构，从而更符合体内微血管的分布，为血管生成相关研究提供一个良好的模型。
　　综上所述，本研究通过双层PDMS薄膜辅助制备了光滑表面的圆柱形凹凸面基底结构，分析并发现了细胞在凹面上容易沿周向生长，而凸面上容易沿轴向生长，并且发现HUVEC具有趋凹性和避凸性。这有助于理解并调控细胞在微拓扑结构上的生长行为。本研究还构建了基于圆柱形微孔阵列的微流控芯片，使HUVECs在微孔中环形生长并出芽和形成交互更优的管腔样结构，这将可以作为血管生成相关研究或药物筛选的一个更优的平台。

目录

英文缩略词对照表

1 绪 论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 本文的研究目的和研究内容

2 凹凸面基底结构基底的制备及评价

2.1 引言

2.2 实验材料及仪器设备

2.3 实验方法

2.4实验结果

2.5 讨论与分析

2.6 本章小结

3 不同细胞在PDMS凹凸面基底上的极化生长

3.1 引言

3.2 实验材料及仪器设备

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论与分析

3.6 本章小结

4 HUVECs在PDMS凹凸面基底结构上的爬行行为

4.1 引言

4.2 实验材料及仪器设备

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论与分析

4.6 本章小结

5 细胞在凹凸面基底上粘附行为的有限元模拟

5.1 引言

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论与分析

5.5 本章小结

6 微流控芯片的制备及功能表征

6.1 引言

6.2 实验材料及仪器设备

6.3 实验方法

6.4 实验结果

6.5 讨论与分析

6.6 本章小结

7 基于微流控芯片构建体外血管生成模型

7.1 引言

7.2 实验材料及仪器设备

7.3 实验方法

7.4 实验结果

7.5 讨论与分析

7.6 本章小结

8 结论与展望

8.1 主要结论

8.2 后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士期间发表的论文

B. 作者在攻读博士期间参加科研项目情况

C. 作者在攻读博士期间取得的科研成果