机械牵张对肺血管内皮炎症反应、通透性的影响及作用机制研究

摘要

背景：
　　急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是ICU病房中发病率及病死率较高的疾病,机械通气是此类呼吸危重症的重要支持手段之一。但呼吸机的应用也可能会导致或加重肺损伤,即呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI),且与之相关的死亡率高达34～60％。VILI的主要特征为肺泡上皮和肺血管内皮通透性的增高以及肺部炎症的发生,其具体发生机制仍然不十分明确,故进一步研究VILI的发生机制,对防治VILI有着重要的临床意义。
　　既往的研究表明除肺泡上皮细胞之外肺血管内皮细胞也是VILI发病机制中重要的靶细胞之一,目前的研究大部分局限于对肺泡上皮的探讨,对肺血管内皮的研究则相对缺乏,深入探索肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cell,HPAEC)及肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMVEC)在机械牵张过程中所产生的炎症反应、通透性的变化以及其中的调节机制,可以进一步丰富对VILI发病机理的认识,从而在分子层面对VILI的防治提供新的线索。
　　目的：
　　观察机械牵张力对人肺动脉内皮细胞(HPAEC)及肺微血管内皮细胞(HPMVEC)炎症反应、通透性的影响,以及研究其中涉及的分子机制,并对比两种细胞对机械牵张力反应的差异性,以探讨VILI的发病机制,为进一步防治VILI提供理论依据。
　　方法：
　　1.采用机械牵张装置Flexcell FX-5000T对HPAEC细胞和HPMVEC细胞以0.5Hz频率施加10%或20%牵张应力牵张3h、6h、12h和24h,应用qRT-PCR、ELISA以及Western Blot方法检测机械牵张前后IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1等指标的基因和蛋白的表达变化情况。
　　2.采用细胞动态分析仪以及Transwell小室/异硫氰酸荧光素(FITC)-白蛋白法对机械牵张后的HPAEC细胞和HPMVEC细胞进行监测,检测机械牵张对HPAEC细胞和HPMVEC细胞通透性的改变情况。
　　3.采用机械牵张装置Flexcell FX-5000T对HPAEC细胞和HPMVEC细胞以0.5Hz频率施加10%或20%牵张应力牵张1h、2h、4h和6h,应用qRT-PCR方法检测机械牵张前后内皮通透性关键蛋白VE-cadherin、Claudin-5和Caveolin-1mRNA的表达变化情况;以0.5Hz频率施加10%或20%牵张应力牵张3h、6h、12h和24h,应用Western Blot方法检测机械牵张前后内皮通透性关键蛋白VE-cadherin、Claudin-5和Caveolin-1蛋白含量的表达变化情况。
　　结果：
　　1.机械牵张可上调HPAEC和HPMVEC细胞IL-8和MCP-1的表达;机械牵张可上调HPMVEC细胞IL-6的表达,而对HPAEC细胞IL-6的表达无影响;同时机械牵张可上调HPAEC细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,但会下调HPMVEC细胞ICAM-1和VCAM-1的表达。
　　2.细胞动态分析仪法以及Transwell小室/异硫氰酸荧光素(FITC)-白蛋白法均证实机械牵张会导致肺血管内皮通透性增高。
　　3.机械牵张对HPAEC和HPMVEC通透性关键蛋白VE-cadherin都有下调作用;机械牵张会下调HPAEC通透性关键蛋白Claudin-5的表达,而对HPMVEC Claudin-5表达无明显影响;同时机械牵张会下调HPMVEC通透性关键蛋白Caveolin-1的表达,而对HPAEC Caveolin-1表达无明显影响。
　　结论：
　　1.机械牵张可上调HPAEC和HPMVEC细胞炎症因子的表达,且对这两种细胞的炎症反应程度有差异性。
　　2.机械牵张会导致肺血管内皮通透性增高,这种增高可能是通过下调内皮细胞通透性关键蛋白VE-cadherin、Claudin-5和Caveolin-1的表达所造成,且HPAEC和HPMVEC这两种细胞对机械牵张力反应有差异性。

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

第一部分：机械牵张对肺血管内皮炎症反应的影响

1.1 细胞复苏

1.2 细胞传代

1.3 细胞冻存

1.4活细胞计数与铺板

1.5机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞及样品收集

1.6细胞总RNA的提取及RNA逆转录为cDNA

1.7 qRT-PCR检测机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞炎症因子表达情况

1.8 免疫印迹实验(Western blotting)

1.9 酶联免疫反应吸附试验(ELISA)

1.10 统计学处理

第二部分：机械牵张对肺血管内皮通透性的影响

2.1 ECIS检测机械牵张后的HPAEC及HPMVEC通透性变化情况

2.2 Transwell小室检测机械牵张后的HPAEC及HPMVEC通透性变化情况

第三部分：机械牵张对肺血管内皮通透性影响的机制研究

3.1机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞及样品收集

3.2 qRT-PCR检测机械牵张HPAEC、HPMVEC通透性关键蛋白mRNA表达情况

3.3 Western blotting检测机械牵张HPAEC、HPMVEC通透性关键蛋白表达情况

3.4 统计学处理

结果

第一部分：机械牵张对肺血管内皮炎症反应的影响

1.1定量PCR检测机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞炎症因子mRNA的表达

1.2 免疫印迹检测机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞ICAM-1和VCAM-1的表达

1.3 酶联免疫法检测机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞IL-6、IL-8及MCP-1的表达

第二部分：机械牵张对肺血管内皮通透性的影响

2.1 ECIS检测机械牵张后的HPAEC及HPMVEC通透性变化情况

2.2 Transwell小室检测机械牵张后的HPAEC及HPMVEC通透性变化情况

第三部分：机械牵张对肺血管内皮通透性影响的机制研究

3.1 定量PCR检测机械牵张HPAEC、HPMVEC细胞通透性关键蛋白VE-cadherin、Claudin-5和Caveolin-1 mRNA水平

3.2 免疫印迹检测机械牵张HPAEC、HPMVEC通透性关键蛋白VE-cadherin、

讨论

第一部分：机械牵张对肺血管内皮炎症反应的影响

第二部分：机械牵张对肺血管内皮通透性的影响

第三部分：机械牵张对肺血管内皮通透性影响的机制研究

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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