木材烟雾凝集物刺激人气道上皮细胞发生转分化样改变

摘要

研究背景：
　　气道重塑是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病理特征和引起不可逆性气流受限的主要原因之一,其中,上皮间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在气道重构中发挥作用。气道上皮细胞可能经由EMT获得成纤维细胞样表型,促进气道重构的发生发展。越来越多研究指出,慢阻肺发病可能与生物燃料(biomass fuels,BMF)烟雾暴露有关。有研究发现,暴露于BMF者肺组织出现纤维化样改变,最近研究发现,烟草烟雾凝集物能诱导人气道上皮细胞发生类似EMT的改变。由此推断,BMF可能通过EMT样的过程引起肺纤维化,从而参与气道重塑。但是,有关生物燃料烟雾在气道重塑发生过程中的机制尚不甚明了。
　　研究目的：
　　本研究观察木材烟雾凝集物(wood smoke condense,WSC)对人气道上皮细胞(16HBE)的损害作用及其对EMT相关标志物及基质金属蛋白酶(MMP9)表达的影响,为生物燃料烟雾暴露致慢阻肺的机制提供线索。
　　实验方法：
　　一、WSC制备:置适量杉木锯末于250ml锥形瓶内以酒精灯引燃,将内附玻璃纤维滤膜的过滤器两边连上胶管,一端置于瓶口收集烟雾,另一端接上60ml注射器,待烟雾出现开始抽吸。抽吸完毕,卸下膜置于皿中,用DMSO溶解凝聚物,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后,离心,沉淀物用DMSO重悬,定量分装备用。
　　二、WSC细胞毒性检测:体外培养16HBE细胞,将细胞分成WSC刺激组、对照组(未给任何刺激物)和烟草烟雾凝聚物(cigarette smoke condense,CSC)刺激组,细胞融合达60％时,分别以5个刺激浓度的WSC(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、50ug/ml)和CSC(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、50ug/ml)对细胞进行干预。至培养第7天,用CCKit-8检测细胞总体活性。
　　三、EMT相关标志物检测:体外培养16HBE细胞,将细胞分成WSC刺激组、CSC刺激组和对照组,待细胞融合达60%时,分别以WSC(10μg/ml)、CSC(10μg/ml)进行干预,对照组不施加任何干预因素,7天后,于倒置相差显微镜下观察细胞形态,以Western-blot法检测16HBE中E钙粘蛋白(E-cad)和I型胶原(COLI)的表达水平;以细胞免疫荧光技术检测16HBE中E-cad、COL1和波形蛋白(vimentin)的表达水平。
　　四、促EMT发生细胞因子基质金属蛋白酶9(MMP9)检测:细胞分组和培养同前。以WSC(10μg/ml)处理16HBE细胞7天后,以Western-blot和细胞免疫荧光技术检测16HBE中MMP9的表达水平。
　　实验结果：
　　一、细胞毒性:CCK8检测显示,WSC和CSC组均在10ug/ml时OD值达最高,分别为2.358±0.072和2.562±0.045,P值均<0.05。
　　二、细胞形态学观察:WSC(10μg/ml)刺激16HBE细胞7天后,部分细胞形态呈现出与CSC刺激相同的改变,由鹅卵石状向长梭形、多角形或星形改变。
　　三、EMT相关标志物的表达水平:Western blot检测结果显示,WSC刺激后,16HBE细胞E-cad蛋白的相对含量(目的蛋白与内参条带光密度的比值)为0.298±0.050,明显低于对照组(0.585±0.078),p<0.05,与CSC刺激组(0.295±0.052)没有明显差别,p>0.05;WSC刺激组COLI蛋白的相对含量为0.578±0.042,明显高于对照组(0.263±0.022),p<0.05,但是和CSC刺激组(0.596±0.019)没有明显差异,p>0.05。细胞免疫荧光技术检测结果显示,WSC刺激后,COL1和vimentin蛋白表达量较对照组增加,而E-cad蛋白的表达量减少;与CSC组比较差异不明显。
　　四、MMP9表达水平:Western blot检测结果显示,MMP9在WSC刺激组(0.558±0.077)和CSC刺激组(0.543±0.103)没有明显差别,p>0.05;但均高于对照组(0.193±0.031),p<0.05。细胞免疫荧光技术显示,经WSC刺激7天后,16HBE细胞中MMP9蛋白与对照组比较,表达量增加;而WSC组和CSC组无明显区别。
　　结论：
　　1、木材烟雾凝集物刺激人气道上皮细胞发生形态学改变;
　　2、木材烟雾凝集物可引起人气道上皮细胞E-cad表达减少,COL1和vimentin表达增加;同时伴有MMP9表达增加;
　　3、木材烟雾凝集物刺激人气道上皮细胞发生的转分化样改变与烟草烟雾凝集物的刺激作用相似。

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中英文对照词汇表

中文摘要

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前言

材料和方法

一、主要材料

1、实验细胞

2、实验试剂

3．自配溶液

4．主要仪器

二、实验方法

1. 冻存细胞复苏

2．支气管上皮细胞16HBE的培养

3. 细胞毒性测定

4. 实验分组及处理

5．16HBE中EMT相关标志物及MMP9表达水平测定

6.统计学分析

结果

一、木材烟雾凝集物刺激后16HBE细胞的形态学特点

二、WSC对细胞毒性的影响

三、EMT相关标志物的检测结果

四、MMP9表达水平

讨论

参考文献

综述

致谢

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