莱氏野村菌Rim15,Ume6和Ime2基因克隆与功能研究

摘要

莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）是一种环境友好型生防真菌，可在自然环境中侵染多种鳞翅目害虫而被用作新型生物杀虫剂。但莱氏野村菌发酵生产对营养要求特殊、产孢条件苛刻，生产周期长，生产成本高等，限制了莱氏野村菌的规模化生产和商业应用。经长期研究，本实验室成功经液体发酵诱导莱氏野村菌微菌核，由于微菌核具有生产效率高、生产成本较低、产品便于储存运输、能稳定持续侵染等特点，开创了利用真菌微菌核作为传统分生孢子制剂替代有效成分的新途径。而从分子层面对莱氏野村菌微菌核的发育机制研究，对于了解真菌对环境适应能力，指导微菌核发酵生长具有重要理论和实际意义。 前期本实验室对莱氏野村菌微菌核形成期的比较转录组测序发现，在微菌核形成过程中莱氏野村菌Rim15,Ume6与Ime2均有上调表达，莱氏野村菌微菌核形成过程中孢子萌发、葡萄糖浓度、菌丝极性生长及氧胁迫均能影响微菌核的产生。而已有的研究报道发现，在不同的真菌中，Rim15可整合多种途径营养信号，响应葡萄糖浓度，参与孢子形成，而且应对氧胁迫是必须的；Ume6参与菌丝极性生长和侵染致病力；Ime2 参与孢子形成，假菌丝生长及侵染致病能力。但上述基因在莱氏野村菌中尤其是其对莱氏野村菌微菌核分化形成尚无相关报道。据此，本研究克隆得到NrRim15, NrUme6 与NrIme2 基因，通过构建敲除菌株对突变体生理形态、应对胁迫、微菌核形成及侵染靶标致病力进行分析，主要获得以下研究成果： ① 基因克隆与序列分析 根据莱氏野村菌基因组克隆得到NrRim15,NrUme6与NrIme2基因全长序列，登录ID分别为OAA39692.1，OAA36838.1与OAA44248.1。生物信息学分析发现NrRim15开放阅读框为5775bp，编码1924个氨基酸，蛋白分子量为210.63 KDa，等电点为6.09，无信号肽和跨膜结构域，含有真菌Rim15-like催化区域、PKc-like Superfamily 蛋白激酶催化区域和 REC 信号接收区域；NrUme6 开放阅读框为1839bp，编码612个氨基酸，蛋白分子量为67.35 KDa，等电点为8.64，无信号肽和跨膜结构域，含有GAL4-like蛋白结合区域和Fungal_trans真菌特定转录因子区域；NrIme2开放阅读框为2322bp，编码773个氨基酸，蛋白分子量为85.06 KDa，等电点为9.55，无信号肽和跨膜结构域，含有STKc_MAK_like蛋白激酶催化区域和PKc_like Superfamily蛋白激酶催化区域，同源性比对和进化树分析发现三个基因均与绿僵菌属的亲缘性高。 ② 基因在莱氏野村菌不同发育阶段及不同条件下的表达模式 对SMAY平板上莱氏野村菌两型转化不同时期的样品进行qPCR分析，发现目标基因在莱氏野村菌两型转化中均有不同程度表达。其中NrRim15和NrIme2在由酵母态向菌丝态转变过程中有较高表达，而 NrUme6 在两型转化过程中表达量程度较低。在微菌核诱导培养过程中，NrRim15,NrUme6和NrIme2基因在微菌核形成的各时期均有表达，前期表达量较低，在微菌核形成高峰期表达量均急剧升高，说明3个基因均参与了微菌核形成。配置10%、50%和90%（添加的量为常规培养基中葡萄糖量的百分比）葡萄糖的诱导培养基，液体培养莱氏野村菌微菌核至大量形成期，对微菌核样品qPCR定量分析发现，NrRim15,NrUme6和NrIme2在不同葡萄糖浓度下表达量无显著差异。 ③ 基因敲除载体构建和突变菌株筛选 扩增获得NrRim15, NrUme6 与NrIme2 基因左右侧翼序列并添加酶切位点。NrRim15左右侧翼引入XhoI（单酶切）和XbaI（单酶切），NrUme6左右侧翼引入EcorI+XhoI（双酶切）和HindIII（单酶切），NrIme2左右侧翼引入EcoRI（单酶切）和 XbaI（单酶切），分析酶切位点的兼容性，选择最佳顺序进行连接，以潮霉素作为筛选标记，成功获得靶标基因的敲除载体。利用农杆菌遗传转化体系进行共培养，使目的基因与敲除载体发生同源置换，经突变体验证鉴定，筛选出稳定遗传的转化子菌株，再通过单孢分离，成功获得目标基因敲除突变菌株，分别命名为△NrRim15,△NrUme6和△NrIme2。 ④ 突变菌株基础生长分析 对 3 个突变菌株的培养特性进行检测分析发现，NrRim15 缺失后延迟了菌株的两型转换，菌丝变粗变长并出现异常膨大，产孢量显著下降；NrIme2 缺失严重影响了菌株的生长速率，菌丝发育迟缓，密度较大的颗粒物增多，产孢延迟，产孢量较野生型略有下降；NrUme6的缺失相比野生型菌株的培养形状无显著变化。所有突变体的孢子在形态上较野生型无显著差异，但 NrRim15 缺失后分生孢子萌发率比野生型有明显降低，NrUme6和NrIme2缺失菌株的孢子萌发率无显著变化。 ⑤ 突变菌株应对不同浓度葡萄糖的生长分析 在不同浓度葡萄糖培养基上（添加的量为常规培养基中葡萄糖量的百分比），野生型和突变菌株的菌落直径大小无显著差别，但菌落形态上 NrRim15 突变菌株在 10%低浓度葡萄糖碳源时较野生型两型转化显著延迟，产孢量较野生型下降51.25%，而较高浓度（50%和90%）的菌落形态类似于野生型呈现白色菌丝状，说明NrRim15在莱氏野村菌响应低浓度葡萄糖时发挥作用，NrIme2和NrUme6缺失菌株与野生型相比无明显差异。 ⑥ 突变菌株应对胁迫生长分析 离子胁迫中，添加NaCl发现NrRim15和NrIme2缺失均导致菌株生长受限，产孢较基础培养基上分别下降88%和94.67%；但在添加KCl后，NrRim15和NrIme2缺失菌株的生长和产孢均有不同程度恢复，其中产孢分别恢复 92.85%和 92.98%；NrUme6 缺失菌株在离子胁迫中与野生型差异不明显。渗透压胁迫中，△NrRim15在甘油和山梨醇胁迫均发现菌株正常生长受抑制，说明 NrRim15 缺失导致菌株对渗透压胁迫的敏感性提高；NrUme6和NrIme2缺失菌株在渗透压胁迫中菌株生长发育较野生型均无明显变化。3 个突变菌株对细胞破坏剂十二烷基磺酸钠（SDS）和刚果红均不敏感，仅发现添加SDS对NrRim15缺失导致菌株生长有较小程度抑制；氧胁迫测定试验结果显示，培养基中添加过氧化氢和甲萘醌后，△NrRim15与△NrIme2 菌株正常生长均被显著抑制，产孢量相对野生型分别下降 90.76%和53.84%，添加甲萘醌后两个缺失菌株生长抑制更为强烈，表现对氧胁迫强烈的不耐受性；NrUme6 缺失菌株在氧胁迫条件下生长发育与野生型无明显差异，说明NrRim15和NrIme2基因在莱氏野村菌氧代谢中起着重要作用，而NrUme6基因不参与该过程。 ⑦ 突变菌株诱导形成微菌核分析 液体诱导野生型和突变菌株微菌核观察分析。结果显示，NrRim15,NrUme6和NrIme2 的缺失对微菌核的正常形成均有不同程度的影响，表现为微菌核形成时间较野生型显著延迟，其中△NrRim15菌核直径变小，致密性和色素沉积降低，微菌核边缘菌丝长而丰富，微菌核产量和生物量分别下降61.53%和40.91%；△NrUme6菌核直径减小，致密性降低，微菌核产量和生物量分别下降 23.07%和 9.09%；△NrIme2微菌核大小不均，边缘菌丝短而稀疏，微菌核产量和生物量分别下降10.05%和18.18%。 ⑧ 突变菌株生物毒力分析 使用斜纹夜蛾三龄幼虫为侵染靶标，以体表点滴和体内注射测定野生型和突变型的侵染力。结果发现NrRim15和NrIme2缺失后侵染的标靶幼虫的死亡率均低于野生型，体内注射实验发现△NrRim15突变菌株和△NrIme2突变菌株的半致死时间比野生型分别延长5.3d和2.4 d，体表侵染实验发现△NrRim15突变菌株△NrIme2突变菌株的半致死时间比野生型分别延长5.0 d和3.2 d，其中△NrRim15菌株侵染的幼虫存活率增高更显著，半致死时间更长，而△NrUme6菌株半致死时间与野生型相差不大，表现出与野生型相似的致病力。受NrRim15和NrIme2突变菌株感染的斜纹夜蛾幼虫后变成僵虫的过程显著延迟，由此可见，NrRim15和NrIme2基因缺失导致侵染致病力下降。△NrUme6菌株侵染的僵虫较野生型无明显差异，说明NrUme6基因与莱氏野村菌对寄主的毒力无关。 结论：NrRim15,NrUme6与NrIme2基因在莱氏野村菌菌株生长发育中起着不同作用，其中NrRim15,NrIme2参与了菌株的氧代谢过程，对菌株的两型转换、菌丝生长、产孢、抗逆力及对斜纹夜蛾的毒力均有不同程度的影响，而NrUme6基因几乎不参与菌株氧代谢，对菌株两型转换、菌丝发育、产孢以及毒力影响不大。3个基因均影响到微菌核发育，基因敲除突变体菌株对微菌核的产量和生物量均有不同程度下降，并且影响到微菌核的形态。但其作用机制还有待于进一步研究。

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