铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833和POH的鉴定及免疫保护作用机制研究

摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）属于非发酵菌中的假单胞菌属，在医院病房及医疗器械中广泛存在，是临床上最为常见的致病菌之一。目前已成为全球呼吸科、烧伤科、ICU病房、老年病科等感染率最高的病原菌之一。随着多重耐药的PA菌株的数量逐渐增加，许多临床分离株对碳青霉烯类抗生素或多粘菌素类抗生素具有耐药性，2017年WHO发布的《全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第1级（最危急级别），这种病原菌引起的感染急需新的治疗方法进行应对，疫苗与抗体是目前理想的选择。从20世纪60年代至今，曾有4种疫苗及3种抗体分别开展了临床试验，但尚未成功，目前尚无一种疫苗进入临床应用，其原因主要是PA致病因素多而复杂，以往PA疫苗采用的抗原类型过于单一，难以激发较全面有效的保护性免疫应答。因此，应该紧密结合PA临床感染的特点，建立相应的动物模型，并综合分析PA致病的关键靶点和机制，综合应用疫苗研发新技术，高效、准确筛选鉴定疫苗保守抗原，构建多靶点、多组分抗原联合疫苗，使得疫苗免疫后能够有效阻断细菌定植和致病的多个通路和环节，达到清除细菌和控制感染的目的。 本课题组前期在建立的PA菌种资源库和临床血清和淋巴细胞样本库的基础上，从PA菌株的全基因组水平出发，基于反向疫苗学技术，全方位筛选出保守性好、特异性高的免疫保护优势抗原42个。本人在博士期间，建立PA感染小鼠肺炎模型（临床感染最为严重），从这42个免疫保护优势抗原中成功筛选出11个保护性抗原，其中新发现6个保护性抗原，包括3个功能已知蛋白（如Ⅵ型分泌系统的关键蛋白Hcp1、外膜蛋白PopB、OprL）和3个功能未知的假定蛋白（如PA0833、PA0807、PA5505）；同时还验证了5个已报道过的保护性抗原（如鞭毛蛋白Flic、Ⅲ型分泌系统关键蛋白PcrV、外膜蛋白OprI、OprF等、外毒素ToxA）。 对于功能未知的保护性抗原，选定保护率最高的PA0833，采用3种PA感染动物模型（肺炎模型、皮肤烧伤合并感染模型和全身感染模型）进一步确定其保护效果。并通过生物信息学分析PA0833的功能，采用生物理化实验、基因敲除实验等方法对PA0833的功能进行分析和验证，以分析PA0833的免疫保护作用机制。最后对筛选出的11个保护性抗原进行多重配伍选择，并进行融合表达，筛选到以PcrV-OprI-Hcp1（POH）为代表的多个高表达、易纯化、高保护率的两亚单位或三亚单位PA融合蛋白疫苗。PA0833蛋白虽然在单个抗原状态下，容易表达和纯化，且具有很好的免疫保护效果，但是在融合蛋白疫苗筛选过程中却没有筛选到包含PA0833亚单位的高表达、易纯化的融合蛋白抗原。然后采用3种PA感染动物模型（肺炎模型、皮肤烧伤合并感染模型和全身感染模型）评价POH的免疫保护性；并体内外实验评价POH苗免疫后的体液免疫和细胞免疫应答水平，从而对POH的免疫保护机制进行初步的探索。主要的结果如下所述： ①铜绿假单胞菌动物模型的建立及保护性抗原的筛选。 为了筛选和评价PA的保护性抗原，根据PA的流行病学调查结果，建立贴近临床感染现状的3种动物模型，即PA感染小鼠肺炎模型、皮肤烧伤合并感染模型和全身感染模型。在小鼠肺炎模型中，PAO1以LD50（5.0×106CFUs/mouse）剂量能够有效感染小鼠，细菌主要在肺脏大量定植、并能使肺脏发生显著的病理改变；以2×LD50（1.0×107CFUs/mouse）剂量感染小鼠，能够通过急性肺炎使小鼠死亡率达到90%左右。在小鼠皮肤烧伤合并感染模型中88℃灼伤8s，能够造成小鼠皮肤Ⅲ°烧伤。PAO1以300CFUs/mouse剂量能够有效感染Ⅲ°烧伤的小鼠，细菌主要在肝脏、脾脏和皮肤大量定植，并能够使小鼠在7天内死亡率达到80%左右。在小鼠全身感染模型中PAO1以LD50（3.5×107CFUs/mouse）剂量能够有效感染小鼠，细菌主要在肝脏和脾脏大量定植；以2×LD50（7.0×107CFUs/mouse）剂量感染小鼠，能够通过全身感染使小鼠死亡率达到90%左右。然后采用急性肺炎模型对候选的42个重组蛋白（免疫优势抗原）进行了筛选，成功筛选出11个保护性抗原。 ②铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833的免疫保护机制及鉴定。 为了对功能未知的保护性抗原PA0833进行评价和鉴定，首先通过PA的动物攻毒保护实验进一步明确，PA0833蛋白在3种PA感染动物模型（肺炎模型、皮肤烧伤合并感染模型和全身感染模型）中都具有很好的免疫保护效果。PA0833蛋白免疫后能诱导机体产生强力的免疫应答，通过显著减少脏器细菌定殖、炎性因子表达和炎性细胞浸润，减轻脏器的病理变化，提高小鼠的生存率。然后通过生物信息学软件分析PA0833蛋白的功能，同时采用生物理化实验（分子筛层析、化学交联分析及肽聚糖结合试验等）对PA0833的功能进行验证，确定PA0833蛋白是OmpA C-like蛋白，其C端结构域能够形成二聚体，并能与肽聚糖结合。最后通过构建PAO1的PA0833基因敲除株及回补突变株，分析了PA0833基因在细菌的生存和致病过程中的作用，证实PA0833基因通过部分参与PA对酸性或强还原剂的耐受过程，从而增强PA对环境压力的适应能力，而且PA0833基因与PAPAO1的毒力相关，且通过激活宿主细胞的NOD样模式识别受体信号通路，参与了机体针对PA的天然免疫应答过程。因此PA0833可作为一种新型的PA疫苗候选抗原。 ③铜绿假单胞菌PcrV-OprI-Hcp1三亚单位融合蛋白候选疫苗的免疫保护效果及机制。 对筛选出的保护性抗原进行多重配伍选择，并进行融合表达，筛选几个高表达、易纯化、高保护率的两亚单位或三亚单位PA融合蛋白疫苗，如PcrV-OprI-Hcp1（POH）等。首先对POH的理化性质进行了检定发现POH在溶液中以稳定的二聚体方式存在，并通过比较四种常用人佐剂选择了Al(OH)3为最优佐剂。然后通过动物攻毒保护实验确定，在肺炎模型、烧伤合并感染模型和全身感染模型中POH比单个抗原（PcrV、OprI、Hcp1）具有更好的保护力，且对不同的PA临床分离株具有广泛的保护作用。POH免疫后能诱导机体产生强力的细胞免疫和体液免疫应答，通过显著减少脏器细菌定殖、炎性因子表达和炎性细胞浸润，减轻脏器的病理变化，提高小鼠的生存率。最后重点从体内外试验评价了POH特异性抗体的功能，证实POH特异性抗体在保护应答中发挥着关键的作用。因此POH可作为一种新型的铜绿假单胞菌疫苗候选抗原。 主要的结论如下： ①新发现的铜绿假单胞菌保护性抗原PA0833在PA感染小鼠急性肺炎模型、烧伤合并感染模型、全身感染模型中均具有很好的免疫保护效果。鉴定PA0833为OmpA C-like蛋白，证实其是新的毒力因子，能够增强PA对环境压力的适应能力，与PA的致病力相关，参与机体针对PA的天然免疫应答过程，这为阐明PA的致病机制提供了基础，为抗PA感染提供了潜在靶点。 ②设计的三亚单位融合蛋白POH，具有高表达、易纯化、可溶稳定均一、高保护率的优点，其免疫后能诱导机体产生强力的全面的细胞免疫和体液免疫应答，从而能在肺炎模型、烧伤感染模型和全身感染模型中减少细菌定植，提高小鼠生存率。这种抗原多组分融合蛋白，为探讨PA疫苗抗原组合形式、协同免疫增强策略提供了实验基础，同时也为研制多联多价的PA疫苗提供重要的实验依据及技术支撑。

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