新型疟原虫传播阻断疫苗候选抗原Pbs54的鉴定及功能研究

摘要

目的：
　　基于疟疾TBV具有重要的科学意义和实际应用价值，本项目采用生物信息学手段于疟原虫数据库中筛选新型疟原虫有性生殖阶段特异性膜表面蛋白PF3D7_0912200，选取其鼠疟伯氏疟原虫（P.berghei）的同源基因Pbs54（PBANKA081330），截取其优势抗原表位区域，应用分子生物学技术构建原核与真核载体，表达、纯化重组蛋白，通过免疫学方法系统评估候选抗原的免疫活性和传播阻断效应。为进一步确定Pbs54基因的功能，我们应用同源重组技术敲除伯氏疟原虫基因组中的相关基因，旨在明确TBV候选蛋白对疟原虫发育的影响及候选蛋白的生物学功能，以期为高效疟疾疫苗的研制开发提供新的理论和实验依据。
　　方法:
　　1、TBV候选蛋白的筛选
　　通过对疟原虫数据库生物信息学分析，确定了疟原虫有性阶段特异性蛋白为PBANKA_081330，DNA长为1368bp，蛋白分子量为53939 Da，数据库显示，其为疟原虫保守的膜蛋白，但生物学功能尚不明确，存在一个信号肽及多个跨膜域，故暂命名为Pbs54。
　　2、Pbs54基因合成及原核表达载体构建
　　P.berghei感染小鼠后第4天（配子含量丰富），从小鼠血液中获得P.berghei总DNA。
　　3、重组蛋白的表达、纯化与DNA疫苗体外瞬时表达
　　将上述PET32a(+)-Pbs54重组载体转入大肠杆菌BL21中，至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中，经IPTG诱导表达重组蛋白，Western Blot验证蛋白正确后，大量收集蛋白样品，使用镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白并检测蛋白浓度。
　　4、实验动物免疫及血清收集
　　(1)蛋白免疫
　　于第3周和第5周再分别给予两次加强免疫，50μg/小鼠（重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合）。
　　(2)核酸免疫
　　每次免疫前一天与末次免疫后第10天，尾静脉收集每只小鼠血液，室温凝集后收集血清。血清抗体滴度、抗血清与重组蛋白反应的活性和特异性分别通过ELISA与Western Blot分析。
　　5、P.berghei裂殖体/配子体分离
　　取1μl涂布在玻片上，甲醇固定后用Giemsa染色，光镜下计数裂殖体与配子体含量，疟原虫经0.01％皂甙-PBS裂解红细胞膜，-80℃冻存。
　　6、动合子培养与分离
　　取1μl涂布在玻片上，甲醇固定后用Giemsa染色检测培养效果。
　　7、ELISA检测血清特异性抗体
　　(1) rPbs54免疫:用溶解在碳酸盐缓冲液的rPbs54(6μg/ml)包被96孔酶标板。
　　(2) PEGFP-N1-Pbs54免疫:用溶解在碳酸盐缓冲液的疟原虫抗原(10μg/ml)包被96孔酶标板。
　　8、间接免疫荧光试验
　　加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶100稀释）20μl，37℃孵育60min，DAPI染色5min，封片，荧光显微镜观察。
　　9、传播阻断效应的观察
　　用抗Pbs21抗体标记培养物，在荧光显微镜下观察动合子数量。
　　10、候选基因的功能研究
　　(1)构建用于获取目的基因敲除疟原虫模型的质粒载体
　　采用基因干扰方法对具有TBV能力的Pbs54蛋白进行功能研究。
　　(2)疟原虫转染
　　通过每只腹腔注射0.2ml PBS稀释的1×106野生株P.berghei，感染两只6周龄BALB/c小鼠。感染1天后即疟原虫完成1次红内期循环，给予乙胺嘧啶饮用水，进行药物筛选。
　　(3) PCR检测疟原虫转染效果及克隆筛选
　　设计PCR鉴定引物，引物1和2扩增出的是野生型;引物1和3及5和6扩增出的是发生同源重组的前端和后端序列。经药物筛选和PCR鉴定正确后，用鼠疟血再感染BALB/c小鼠，至红细胞感染率达1％左右，取血，用生理盐水稀释至1ml含有5个疟原虫，每只小鼠尾静脉注射100μl进行克隆，从而获取基因型一致的疟原虫。
　　11、Pbs54（-）与WT疟原虫形态与功能的比较
　　于小鼠感染的第3天尾静脉取10μl血液置于90μl动合子培养液中，疟原虫在25℃下培养15min，用普通显微镜观察配子出丝数。另外取10μl血液置于90μl动合子培养液中，疟原虫在19-20℃下培养24h，用抗Pbs21抗体标记培养物，在荧光显微镜下观察动合子数量。
　　12、统计分析
　　应用GraphPad Prism5.0统计软件对实验数据进行统计分析，原虫血症的组间比较采用Student's t检验，生存曲线分析采用log-rank(mantel-cox)分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1、rPbs54载体构建及其表达、纯化
　　成功构建了PET32a(+)-Pbs54原核表达载体，并转至大肠杆菌BL21表达系统，加入1 mM IPTG，经20℃诱导20h后，SDS-PAGE电泳分析可见大量可溶性目标蛋白Pbs54(～35kD)的表达。使用His-tag镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白，并对洗脱及透析后的样品进行Western blot检测，可清晰看到目标蛋白条带，检测其蛋白纯度＞80％，浓度可达到0.5mg/ml。
　　2、DNA疫苗的构建及体外瞬时表达
　　成功构建了PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗载体，经测序后其碱基序列与Genebank公布的完全一致。应用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒后，成功转染至Vero细胞，培养24h后应用荧光显微镜可见GFP绿色荧光的表达。
　　3、免疫血清特异性抗体检测
　　(1) rPbs54免疫血清:ELISA结果显示，于初次免疫后2周，重组蛋白免疫组小鼠血清特异性抗体水平显著升高。两次加强免疫后抗体一直维持在较高水平，与单纯佐剂组相比差异显著(P＜0.01)。重组蛋白初次免疫后，抗体效价大约为1∶20000，加强免疫后效价可超过1∶320000。与对照组相比具有统计学差异。
　　(2) PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗免疫血清:ELISA结果显示，初次免疫后3周，疫苗免疫组小鼠血清抗体水平即开始升高。两次加强免疫后抗体一直维持较高水平，与空质粒组相比差异显著(P＜0.01)。PEGFP-N1-Pbs54初次免疫后，抗体效价约为1∶1600，加强免疫效价达1∶3200，与对照组比较具有统计学差异。
　　4、Pbs54蛋白表达特点的确定
　　间接免疫荧光显示，rPbs54重组蛋白与PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗组抗血清处理后的玻片，在荧光显微镜下可见带有绿色荧光的动合子，而对照组未见绿色荧光表达的动合子。Western blot实验显示，重组蛋白与DNA疫苗组抗血清可与纯化后的动合子结合形成明显的条带，与纯化后的裂殖体、配子体可结合形成微弱的条带，证实Pbs54蛋白主要在动合子阶段表达，同时证实抗血清能够特异性结合天然的疟原虫抗原。
　　5、合子、动合子培养及其计数
　　与对照组相比，rPbs54重组蛋白免疫后的小鼠血清与疟原虫共同培养24h后，可见动合子数量明显减少，具有统计学意义。
　　与对照组相比，PEGFP-N1-Pbs54 DNA疫苗免疫后的小鼠血清与疟原虫共同培养24h后，可见动合子形成数量有减少趋势。
　　6、打靶载体的构建
　　提取P.berghei的基因组DNA，通过在线软件primer-BLAST设计出打靶载体构建引物，使用引物分别PCR扩增了所需碱基序列，并使用分子克隆方法构建了打靶载体PLOO34-Pbs54，酶切鉴定正确，测序结果表明符合打靶要求。
　　7、Pbs54基因敲除型疟原虫虫株Pbs54(-)的构建
　　使用Amaxa nucleofector技术成功实现了将线性化的PLOO34-Pbs54载体电转染至疟原虫裂殖体中，并经乙胺嘧啶筛选出重组疟原虫，通过有限稀释法获取了单个的重组疟原虫克隆Pbs54(-)，经PCR方法鉴定获得的Pbs54(-)虫株成功导入了耐药基因并成功敲除了Pbs54基因。
　　8、Pbs54(-)虫体形态与发育观察
　　Pbs54(-)虫株的环状体、裂殖体、配子体与动合子形态与野生型P.berghei比较无明显变化，BALB/c分别感染1×107个Pbs54(-)与WT疟原虫后，其血液阶段的感染无明显差异，配子体出丝数无明显变化。与对照组比较，Pbs54(-)动合子形成数量减少，提示Pbs54蛋白可能在疟原虫有性生殖阶段发挥作用。
　　结论：
　　1、成功构建了疟原虫Pbs54原核表达重组蛋白(rPbs54)和Pbs54 DNA疫苗。
　　2、纯化后的rPbs54与Pbs54 DNA疫苗经动物免疫证实具有良好的免疫原性和抗原性。
　　3、Pbs54蛋白主要表达于动合子表面，rPbs54与Pbs54 DNA疫苗免疫后小鼠的抗血清具有一定的传播阻断效应，提示Pbs54是一种良好的新型传播阻断疫苗候选抗原。
　　4、利用PL0034-Pbs54基因敲除载体成功敲除了Pbs54基因，获得了Pbs54(-)型疟原虫虫株。
　　5、Pbs54(-)型虫株与野生型P.berghei比较，其环状体、裂殖体、配子体和动合子的形态学无明显变化，无性阶段原虫感染率无明显变化;但Pbs54(-)疟原虫的动合子形成数量有减少趋势。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 新型TBV候选抗原Pbs54原核表达系统与核酸疫苗的构建及其传播阻断活性的检测

前言

一、实验材料

二、方法

三、结果

讨论

结论

论文二 Pbs54(-)基因敲除型疟原虫的构建及其表型的初步研究

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 间日疟传播阻断疫苗主要候选抗原研究现状

在学期间科研成绩

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