长寿沙田柚丛枝菌根及其Ri T-DNA转型根优化培养体系研究

摘要

丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalFungi，简称AM真菌或AMF)作为一种新型的生物肥料，存在于几乎所有类型的土壤中，可以与绝大多数被子植物的根共生；大多数农作物、果树、蔬菜、观赏植物和花卉等都能形成丛枝菌根。 AM真菌在植物和土壤间起着桥梁的作用，是植物和土壤间物质运输的载体。这种从植物到土壤和从土壤到植物的物质运输的载体，对植物和土壤的发育与健康都十分重要。由于丛枝菌根在可持续农业和生态重建中所具有的重要意义，近年来，世界各国对植物菌根及菌根真菌的研究方兴未艾。已被证实，AM真菌可增加植物对水分和矿质营养的吸收，促进植物生长，提高作物抗逆性和抗病性，改良土壤，提高苗木移栽成活率，提高产量和改善品质等。因此，AM真菌在生态系统重建、生态平衡的维护以及农林业生产中具有重要的意义和广泛的应用。柑桔根系缺少根毛，对丛枝菌根的依赖性强。近年来，柚类发展迅速，长寿沙田柚(Citrusgrandiscv.ChangshouShatianYou)为重庆地方发展的名柚。论文以丛枝菌根研究为切入点，围绕长寿沙田柚菌根研究这一中心，力图在长寿沙田柚良性生态果园建设方面作些探讨和研究。 由于长寿沙田柚的丛枝菌根研究、毛状根诱导等都应在无菌条件下进行，因此，获得优质的无菌苗是进行一系列研究的基础。通过无菌苗的培育，研究长寿沙田柚苗期的发育生物学特征及培育的关键技术。重点研究了见光时间对苗期生长的影响，即在播种的第5d、6d、7d、8d和9d见光，分别比较了地下部分和地上部分30d内的生长情况，综合分析表明：第6d见光的苗子生长最好；对上述5个处理，分别在播种的第12d、15d、18d、21d、24d和27d进行移栽，通过移栽后生长势的观察比较，播种第18d、21d和24d移栽效果最好，且无显著差异。 AM真菌与转型RiT-DNA胡萝卜(DaucuscarotaL.)根器官双重培养体系是研究AM真菌菌丝功能的有效方法。这种方法中，作为宿主的转型RiT-DNA胡萝卜根促进了某些AM真菌孢子生产。利用这种原理和方法，笔者试图从长寿沙田柚中筛选出适宜的外植体，以期获得足量的转型根用于筛选高亲和性或高效AM真菌菌种(菌株)，并开展长寿沙田柚菌根的生理生态研究。 实验设计了长寿沙田柚无菌苗不同外植体在光、暗条件下进行发根农杆菌遗传转化的试验，建立了长寿沙田柚RiT-DNA转型根优化培养体系，该体系为：用对数期的发根农杆菌A4菌株感染活化胚中单片子叶的创伤腹面，25℃±2℃暗培养25～30d，多数子叶上发出转型根(毛状根)，遗传转化率达83±11﹪。继代脱菌5代后获得无菌转型根。外植体活化采用MT培养基，继代脱菌培养采用MS培养基。采用这个体系获得了大量激素自主的长寿沙田柚RiT-DNA转型根。获得的新鲜转型根白色，长1.14±0.07cm，粗0.73±0.04mm，负向地性生长。 离体双重培养体系的广泛应用，对孢子的消毒方法提出了更高的要求。而现有的消毒方法中，AM真菌孢子表面消毒效果还不很稳定，因此，AM真菌孢子消毒方法的优化研究具有非常关键的作用。本文采用七种消毒方法，对Gigasporamargarita、Glomusmosseae和Glomusversiforme三种丛枝菌根真菌孢子分别进行表面消毒试验。结果表明，Gigasporamargarita的孢子，采用5﹪氯胺T+0.04﹪链霉素消毒液+2滴Tween20处理15min，无菌蒸馏水漂洗6～10次的消毒方法最好，萌发率高，且消毒效果好；Glomusmosseae和Glomusversiforme两种孢子，可采用上述方法或“差别灭菌法”，即先用2﹪氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素消毒液+2滴Tween20处理10min，无菌蒸馏水漂洗6～10次后，置于26℃条件下培养3d，再用2﹪氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素消毒液+2滴Tween20处理10min，最后用无菌蒸馏水漂洗6～10次即可。这两种方法都非常好，消毒效果没有显著差异。长寿沙田柚丛枝菌根的研究对柑桔生理生态的研究具有重要意义。本实验对长寿沙田柚实生无菌苗接种不同的AM真菌，旨在探讨AM真菌种间差异对其生长及矿质含量的影响，并筛选适宜的优良菌种(菌株)，为AM真菌的实际应用提供理论依据。 试验以长寿沙田柚无菌苗为材料，在温室盆栽条件下研究了3种AM真菌Gigasporamargarita、Glomusmosseae和Glomusversiforme对长寿沙田柚无菌苗营养生长及矿质含量的影响。结果表明，接种AM真菌的植株均有效地被感染；与对照相比，接种AM真菌能显著促进植株地上和地下部分生长，尤其促进了须根的生长，接种Glomusmosseae处理的主根长度比对照增加了22.7﹪，侧根数量增加了35.7﹪，须根数量和总长分别增加了160.8﹪和103.2﹪；接种AM真菌显著提高了叶片N、P、K、Ca、Mg、Zn、Cu和Mn的含量，与对照相比，3种真菌处理的P含量分别增加了46.8﹪、88.7﹪和32.3﹪。3种AM真菌处理中，以接种Glomusmosseae处理营养生长最好，菌根依赖性最大，矿质元素N、P、K、Ca、Zn和Cu的含量最高，其效应顺序为Glomusmosseae＞Gigasporamargarita＞Glomusversiforme，可见，3种AM真菌对长寿沙田柚均有正效应，以Glomusmosseae最为显著，为长寿沙田柚适宜的优良菌种(株)。

目录

文摘

英文文摘

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第1章文献综述

第2章引言

第3章材料与方法

第4章结果与分析

第5章结论与讨论

参考文献

英文缩写词

附录

致谢

发表论文及参研课题