柑橘毛状根的诱导及其与丛枝菌根真菌的双重培养

摘要

柑橘可以和丛枝菌根真菌形成互惠共生体——丛枝菌根。丛枝菌根真菌可以帮助根毛稀少的柑橘获取水分和矿质营养，促进柑橘生长发育，增强柑橘抗逆境能力，而柑橘可以为丛枝菌根真菌提供所需的碳源。鉴于丛枝菌根对柑橘的重要性，开展柑橘丛枝菌根的相关研究势必会对柑橘产业的可持续发展产生深远影响。 本研究尝试利用发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化的柑橘毛状根与丛枝菌根真菌建立双重培养系统，以期为柑橘丛枝菌根的离体研究建立一个初级平台。主要结果如下： 1.以发根农杆菌A4d菌株转化40d龄的枳(Poncirustrifoliata(L.)Raf.)上胚轴，研究鱼鳞状划伤处理对毛状根诱导率的影响，其结果为：经过鱼鳞状划伤处理的上胚轴的转化率为66.7％，未经鱼鳞状划伤处理的上胚轴转化率为29.2％，差异显著。2.以发根农杆菌A4t菌株转化经过鱼鳞状划伤处理的柠檬(Citruslimon(L.)Burm.)外植体，结果为：①生长15d和105d的柠檬的上胚轴转化率分别为70.8％和83.3％，差异不显著；②生长15d的柠檬的上胚轴和子叶的转化率分别为67.5％和23.3％，差异显著。结果表明柑橘外植体类型是影响转化率的重要因素之一，而苗龄次之；上胚轴适度老化可以提高转化率。 3.柠檬毛状根显示出形态变异性和形态多样性，通过单克隆筛选获得优良的柠檬毛状根克隆OL2-1、OLxx1、OL13-2、YL22-4和YL8-1。枳毛状根只有伸长能力，不具有分枝能力，没有获得优良克隆。 4.柠檬毛状根克隆OL2-1在同种培养基上2w和4w后的净生长量差异不显著，而在不同种培养基上2w或4w后的净生长量却有显著差异。毛状根在培养基Ⅳ生长量超过10.0mm，4w后绝大多数毛状根保持基本活力；毛状根在培养基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ上的生长量不足3.5mm，4w后几乎全部死亡。结果表明Tris·HCl缓冲液极有可能对克隆OL2-1有毒害作用，并使其致死；而培养基中营养元素不均衡是次要因素。 5.丛枝菌根真菌孢子在培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ上的萌发情况具有显著的种间差异性，而无显著的种内差异性。珠状巨孢囊霉GigasporamargaritaBecker&Hall(NC121A)孢子和摩西球囊霉Glomusmosseae(Nocolson&Gerd.)Trappe&Gerd.(CA127)孢子的平均萌发率分别为38.0％和3.3％，。低于前人的研究结果。这表明AMF孢子对培养基有较广泛的适应性，孢子活力系影响孢子萌发率的主要因素，孢子活力具有种属差异性。 6.在培养基Ⅳ上将珠状巨孢囊霉孢子和摩西球囊霉孢子分别接种到克隆OL2-1根尖处，尝试建立双重培养系统。珠状巨孢囊霉与克隆OL2-1成功建立双重培养，形成丛枝菌根，但是未产孢；摩西球囊霉与克隆OL2-1未实现双重培养。孢子种类、孢子活力、种内孢子类型、培养皿如何放置等都是影响双重培养建立的诸多参数。

目录

摘要

缩写词表

前言

1问题的提出

2发根农杆菌介导遗传转化的研究进展

2.1发根农杆菌转化植物的研究现状

2.2发根农杆菌转化植物的应用

3(丛枝)菌根的研究现状

3.1菌根的类型

3.2丛枝菌根研究进展

3.3双重培养研究概况及应用进展

4本研究的目的和内容

材料与方法

1柑橘毛状根的获得

1.1柑橘材料的准备

1.2供试菌株的活化

1.3发根农杆菌转化柑橘材料

1.4柑橘毛状根的诱导与发生

1.5柑橘毛状根优良克隆的筛选

2柠檬毛状根优良克隆在培养基中的生长表现

3培养基对AMF孢子萌发的影响

3.1 AMF菌种的扩繁

3.2 AMF孢子的分离

3.3 AMF孢子的表面消毒

3.4AMF孢子的萌发试验

4柠檬毛状根与AMF的双重培养

4.1柠檬毛状根OL2-1克隆的准备

4.2毛状根和AMF孢子的接种、培养及观察

4.3 AM的制片观察

结果与分析

1柑橘毛状根的诱导与培养

1.1柑橘毛状根的发生过程与生长特性

1.2鱼鳞状划伤处理对枳毛状根诱导率的影响

1.3柠檬外植体类型及苗龄对毛状根诱导率的影响

1.4柑橘毛状根优良克隆的筛选

2柠檬毛状根OL2-1克隆在不同培养基中的生长表现

3 AMF孢子萌发试验

4柠檬毛状根OL2-1克隆与AMF孢子的双重培养

4.1双重培养建立过程的观察

4.2双重培养建立过程的相关问题比较

讨论

1影响发根农杆菌介导的柑橘转化的因素

2柑橘毛状根诱导过程及生长特性的观察

3孢子萌发试验与双重培养的建立

图版和图版说明

图版1柑橘毛状根的诱导过程

图版2柠檬毛状根的形态变异性和形态多样性

图版3柠檬毛状根的生长特点

图版4珠状巨孢囊霉与柠檬毛状根的双重培养过程

参考文献

致谢

附录

附录1 AMF孢子分离程序

附录2 AMF孢子消毒程序

附录3 AM制片程序