操作液中不同添加物对猪ICSI影响及相关问题研究

摘要

单精子胞质内显微注射(ICSI)技术能够提高配子利用率，获取所需性别动物，解决雄性动物少精不孕问题，作为辅助技术在转基因工程研究领域具有重大作用。在实施ICSI操作过程中，通常在操作液中添加PVP(聚乙烯吡咯烷酮——一种高分子物质)来降低精子运动性，减少注射针与精子的粘连，便于操作。但是，PVP同精子一起注入到胞质内会包围在精子周围，不但使精子质膜变得坚韧影响破裂，影响精核解聚，而且阻碍精子向胞质释放使卵母细胞激活的精子蛋白，影响卵母细胞的活化，使ICSI的成功率受到严重影响；但是，不添加PVP由于粘连会明显增加显微操作难度。 本试验针对ICSI技术存在的注射针粘连、卵膜柔韧程度、PVP物质包绕精子、精子解聚困难和卵母细胞活化不足等问题，通过研究ICSI操作液中防粘连物质的使用和选择可以替代PVP的新的生理性防粘连物质，减少PVP所产生的不良影响，探索克服和解决这些ICSI技术问题的方法，提高猪ICSI效果。 本试验目的是研究作为PVP替代物质的HA(透明质酸)，配合在操作液中使用CB(细胞松驰素B)，进行猪ICSI操作的基本程序，通过减少传统的在操作液中使用PVP存在的不良作用，提高猪ICSI胚胎发育率。试验首先通过传统的方法，在操作液中添加PVP进行ICSI操作，研究精子解聚和原核形成的时间；进而研究ICSI后卵母细胞的电、化学激活方法；操作液中添加CB的辅助作用；在固定电、化学激活参数和原核观察时间的基础上，试验选择和PVP有类似润滑作用的生理性物质HA，分别对PVP和HA的适宜操作浓度进行了研究；最后以卵裂率、8-细胞以上胚胎发育率为指标比较在最适PVP和HA浓度下两种防粘连物质对猪ICSI效果的影响。研究结果如下： 试验一：猪ICSI后精子解聚和原核形成时间观察。采用猪精子进行ICSI，分别于注射后7h、10h、13h、16h和19h通过荧光染色观察精核解聚和原核形成情况。ICSI后7小时仅有5.2％的精子解聚，并未见到雌雄原核的形成。ICSI后10h，12.5％精子进入解聚状态；ICSI后13h，处于精核解聚状态的精子所占比率增至29.0％，有6.5％精子已经形成雄原核；ICSI后16h，16.7％精子处于解聚状态，雄原核形成率迅速增至28.8％；ICSI后19h，12.5％精子处于解聚状态，41.7％精子形成雄原核。结果表明精核解聚主要发生在ICSI后13h-16h，雄原核形成率随着时间延长而增。这为后面试验观察解聚精子和原核形成提供了时间依据，观察精核解聚和原核形成的时间为ICSI后16h为宜。 试验二：不同激活方法对猪ICSI效果的影响。在本试验中，针对卵母细胞ICSI后活化不足的问题，在ICSI后进行一般性电激活(场强0.4KV/cm、脉冲时程90μs、一次脉冲)的基础上，之后分为三组，对照组在电激活清洗后直接放胚胎液中培养；其他两组分别在电激活后用2mmol/L6-DMAP、10ug/mlCHX处理6h，进行化学补充激活，清洗后放入胚胎液中培养。结果表明，对照组卵裂率低于6-DMAP组和CHX组，与6-DMAP组差异极显著(41.0％vs44.3％)(p＜0.01)，与CHX组差异显著(41.0％vs43.5％)(p＜0.05)。对照组8-细胞以上胚胎数低于6-DMAP组和CHX组，与6-DMAP组差异极显著(14.1％vs19.0％)(p＜0.01)，与CHX组差异显著(14.1％vs17.6％)(p＜0.05)。6-DMAP组和CHX组之间卵裂率和8-细胞以上胚胎数无显著差异(p＞0.05)。上述结果说明：猪体外成熟卵母细胞ICSI后仅依靠电激活不足以使MII期中期的卵母细胞活化，采用电激活+6-DMAP(或CHX)激活，能够有效活化卵母细胞，降低MPF分子作用，从而提高ICSI胚胎的发育效果，后面试验均采用6-DMAP进行化学补充激活。 试验三：操作液中添加CB对ICSI效果的影响。本试验针对注射精子时卵膜的脆弱易损问题，比较在操作液中添加CB与对照组(不添加CB)的试验效果。试验组卵裂率高于未加CB组的对照组(46.7％vs43.7％)，差异显著(p＜0.05)，试验组8-细胞以上胚胎数高于对照组(18.7％vs18.3％)，差异不显著(p＞0.05)，说明注射卵母细胞的操作液中添加CB不但能够使操作容易进行，而且还可以改善猪ICSI受精卵的卵裂效果。 试验四：操作液中添加不同浓度PVP对ICSI效果的影响。试验选择5％和10％两组PVP浓度进行试验，结果表明两组解聚精子数无显著差异(16.5％vs16.8％)(p＞0.05)，5％PVP组雄原核形成数高于10％PVP组(28.7％vs23.7％)，差异显著(p＜0.05)，5％PVP组卵裂率高于10％PVP组，差异显著(46.7％vs42.2％)(p＜0.05)，5％PVP组8-细胞以上胚胎数略高于10％PVP组，差异不显著(18.7％vs17.6％)(p＞0.05)。结果说明降低PVP浓度有利于雄原核形成，能够提高猪ICSI卵的卵裂率。 试验五：操作液中添加不同浓度HA对ICSI效果的影响。试验选择在操作液中添加0.5mg/ml、1.Smg/ml和2.5mg/ml三组HA浓度进行试验，结果表明三组解聚精子数(16.0％Vs15.7％，16.2％)和雄原核形成数(30.2％vs30.4％，29.3％)无显著差异(p＞0.05)。0.5mg/mlHA组卵裂率低于其他两组，差异极显著(46.0％vs50.1％，49.6％)(p＜0.01)，1.5mg/mlHA组与2.5mg/mlHA组卵裂率(50.1％vs49.6％)和8-细胞以上胚胎数(22.4％vs21.2％)差异不显著(p＞0.05)，0.5mg/mlHA组8-细胞以上胚胎数最低。操作液中添加1.5mg/mlHA更有利于注射卵的发育。 1.5mg/mlHA组和5％PVP组相比较，操作过程中润滑作用相似，两组解聚精子比率之间无显著差异(p＞0.05)；HA组雄原核形成率、卵裂率、8-细胞以上胚胎数都显著高于PVP组(30.4％vs28.7％)(50.1％vs46.7％)(22.4％vs18.75％)(p＜0.05)。结果表明，操作液中用1.5mg/mlHA代替5％PVP更有利于注射卵的发育。 结论：猪ICSI操作过程中，操作液中添加CB，并且用1.5mg/mlHA代替5％PVP，电激活后再用6-DMAP处理6h对卵母细胞进行化学补充激活能够明显改善猪ICSI胚胎的发育效果。与传统的在猪ICSI操作液中添加PVP的方法相比，从精子解聚、原核形成、卵裂率、8-细胞以上胚胎数等多方面统计结果可以看出，所选择的HA不但能够像PVP一样增加润滑程度、减少精子对注射针的粘附，而且还使精、卵之间的互作加强，猪ICSI效果明显提高。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及学位论文版权使用授权书

文献综述

一、猪显微受精技术研究

二、ICSI操作程序

2.1卵子的收集和处理

2.2精子或精核的准备

2.3精子或精核的显微注射

2.4注射卵的激活

2.5 ICSI受精卵的培养

三、影响ICSI的成功的技术因素

3.1显微操作系统影响

3.2显微操作工具

3.3 PVP的浓度

3.4注射时卵母细胞第一极体的位置

3.5精子注射前的制动

3.6卵质膜的破裂

四、影响ICSI的成功的非技术因素

4.1卵母细胞的状态

4.2卵龄

4.3精子状态

4.4精子的发生阶段

4.5精子的预处理

4.6卵子在注射前的处理

4.7注射卵的激活

五、精子胞质内显微受精技术的应用前景

5.1提高珍贵动物配子的利用率，扩大配子的利用范围

5.2提高体外成熟卵母细胞的受精率

5.3研究人和其他动物的雄性不育

5.4性别选择

5.5简化转基因的方法

5.6应用于生殖和发育机制的基础研究

六、精子胞质内显微受精技术存在的问题

6.1 ICSI对卵子的损害

6.2总体效率低

6.3单性生殖情况

6.4 ICSI精子的选择与遗传

6.5设备昂贵、操作复杂、成本较高，不利于生产推广

试验部分

引言

一、材料、方法与试验设计

1.材料

2、方法

3、试验设计

4、数据分析

二、结果

1、ICSI后猪精子解聚和原核形成时间观察

2、不同激活方法对ICSI卵发育的影响

3、细胞松弛素B(CB)对卵母细胞ICSI后发育的影响

4、操作液中不同浓度PVP对ICSI卵发育的影响

5、操作液中不同浓度HA对ICSI卵发育的影响

三、分析讨论

1、ICSI后猪精子解聚和原核形成时间观察

2、不同激活方法对ICSI卵发育的影响

3、细胞松弛素B(CB)对卵母细胞ICSI后发育的影响

4、操作液中PVP或HA对ICSI效果的影响

四、结论

参考文献

附录1：缩略词表

附录2：图片说明

致谢

发表论文：