MHC-肽四聚体的构建及其技术改造研究

摘要

背景和目的 细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc）在T细胞免疫应答中发挥着重要的作用，它通过识别靶细胞表面的MHC—肽复合物而对靶细胞进行杀伤。检测和监测抗原特异性CTL，是了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一，也是评价特异性免疫疗法的基础。抗原特异性CTL的体外检测方法有多种，但MHC—肽四聚体技术是目前唯一能够直接对其定量检测的方法。然而，MHC—肽四聚体构建过程复杂，价格昂贵，这在一定程度上限制其大规模应用，这就要求我们一方面要构建针对不同抗原表位的MHC—肽四聚体，另一方面也要求我们开展MHC—肽四聚体技术改造研究，简化MHC—肽四聚体制备过程，提高其实用性和可操作性，开发具有自主知识产权的产品，以适合和满足我国医学飞速发展的需要。另外，慢性HBV感染是一个全球性的重大健康问题。HBV有多种抗原成分，而每种抗原成分包含有多个抗原表位，构建HBV不同抗原表位的MHC—肽四聚体很有必要。 本文首先使用MHC—肽四聚体构建的基本方法构建HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体，一方面可以为检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107—115表位特异性CTL打下基础，另一方面摸索和掌握MHC—肽四聚体构建技术，可以为构建其它抗原表位的MHC—肽四聚体或为建立抗原特异性CTL检测的技术平台打下基础；其次将SCT改造为HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体，以期为MHC—肽四聚体技术改造提供新思路。 试验方法 （1） HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体的构建 分别将重组A2—BSP和β2m的载体用化学法转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，对转化菌落进行培养和用IPTG诱导，表达出包涵体蛋白；提取两种包涵体蛋白，经SDS—PAGE电泳分析表明两个蛋白均被表达，大小分别为33KD和12KD；将两种包涵体蛋白和HBcAg107—115抗原肽共同稀释复性，以组装成MHC—肽复合物单体；用超滤器浓缩复性产物；用凝胶过滤层析技术纯化MHC—肽复合物单体，经SDS—PAGE电泳分析表明获得了目的蛋白；MHC—肽复合物单体在BirA酶的作用下生物素化；用超滤管离心去除生物素化产物中游离的生物素；用直接ELISA法定性鉴定生物素化产物；用BCA法测定生物素化蛋白浓度，并将生物素化蛋白和PE标记的链亲和素以4：1的量混合作用，从而得到MHC—肽四聚体。 （2） HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体活性的检测 取免疫的转基因鼠两只，其中一只为对照;取出脾脏，分离出脾脏细胞并调节浓度;先后用制备的MHC-肽四聚体、FICT标记的anti-CD8+抗体和PE-Cy5标记的anti-CD3+抗体对脾脏细胞染色，使用流式细胞术分析CD3+、CD8+和MHC-肽四聚体+的细胞群频率。 （3） SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体 将BirA酶底物序列和PreScission蛋白酶切位点序列分别设计成引物，引物中引入BamHI和XhoI酶切位点，以pcDNA3．0-SCT为模板，通过重叠PCR技术，获得依次含PreScission蛋白酶切位点、SCT和BirA酶底物的基因序列;获得的基因序列用BamHI和XhoI酶后，与同样酶切过的载体pET32c（+）连接;连接产物用电转化法转化大肠杆菌JM109中;先进行抗性筛选，对获得的克隆再进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，获得重组载体;用化学法将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中;对转化菌落进行培养和用IPTG诱导，分离菌体进行SDS-PAGE电泳分析，表明蛋白以包涵体存在，大小与预期一致;提取包涵体，进行稀释复性;用超滤器浓缩复性产物;复性产物换用PreScission蛋白酶缓冲液，加入PreScission蛋白酶以切除融合表达的标签;酶切产物经SDS-PAGE电泳分析表明大部分蛋白被切开;酶切产物先后经Ni离子亲和层析和GST亲和层析纯化，经SDS-PAGE电泳分析表明获得了纯的目的蛋白;对目的蛋白再进行和MHC-肽四聚体构建的基本方法一样的生物素化等过程，最后得到MHC-肽四聚体。 （4）对比分析构建MHC-肽四聚体的两种方法，得出基于SCT构建MHC-肽四聚体的优越性。 结果和结论 （1）构建了有活性的HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体，可以将其用于检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL。 （2）构建了重组载体pSB1，为今后进一步研究SCT-BSP可溶性表达打下了基础。 （3）将SCT-BSP构建成了MHC-肽四聚体，其方法相比构建MHC-肽四聚体的基本方法具有方便、快捷、节约成本和适合规模化生产等优势，为MHC-肽四聚体技术改造提供了新思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1 T细胞概述

1.2 HLA I类分子的结构与功能

1.3 抗原特异性CTL检测的意义

1.4抗原特异性CTL检测的方法

1.5 MHC-肽四聚体技术的进展及应用前景

1.6 MHC-肽四聚体技术用于HBV抗原特异性CTL检测的意义

第2章 引言

2.1研究背景

2.2研究内容

2.3研究目的和意义

第3章MHC-肽四聚体的构建及鉴定

3.1 试验材料

3.2试验方法

3.3结果与分析

第4章改造方法构建MHC-肽四聚体

4.1 试验材料

4.2试验方法

4.3结果与分析

第5章 构建MHC-肽四聚体的两种方法对比分析

5.1抗原表位肽的合成成本比较

5.2蛋白的表达、提取和纯化过程比较

5.3包涵体蛋白的复性过程比较

5.4 MHC-肽单体的纯化方法比较

第6章讨论与结论

6.1 讨论

6.2结论

参考文献

附录1 pET32a-c(+)克隆表达图谱

致谢

硕士期间发表的论文