热激与四环素双重诱导调控的植物基因表达系统研究

摘要

在植物转基因研究中，建立或获得一种严紧、高效、灵敏、特异及可诱导调节的基因表达调控系统，不仅在对目的基因进行精确和经济地调控方面具有重要利用价值，而且便于研究目的基因在特定发育时期和发育部位的功能，因此，一直倍受国内外学者的重视。目前，可应用的植物调控系统很多，如温度诱导、植物激素诱导(如ABA、IAA、Auxin)、光诱导、胁迫诱导、金属盐离子诱导等。但是，现有的这些诱导系统都存在诱导多元性这一致命的弱点。现在应用最为广泛的是四环素调控系统，主要有tet-off系统(tTA，tetracycline transcriptionalactivator)和tet-on系统(rtTA，Reveres tetracycline transcriptional activator)两类。但是目前所建立的这两种系统都存在一定的缺陷，如在系统关闭时仍有较高水平的泄漏表达、构建的杂合启动子启动效率不高、较高浓度的四环素(tet)对细胞或植株具有一定的毒害，同时与tTA系统相比，rtTA系统即使是在非诱导状态，rtTA与tetO仍有一定的亲和力，仍可诱导基因表达，导致目的基因的基础表达水平很高。鉴于此，本文采用tTA系统工作原理，构建了一新型热激与四环素双重诱导的tTA系统，以期能在较大程度上使对目的基因的表达调控更加严紧、高效、灵敏且具有广普性。主要研究结果如下： 1．将含有4个四环素操纵子元件TetO的序列与花椰菜花叶病毒CaMV35S微启动子(-46bp mini 35S promoter)片段连接，构建成含四环素操纵元件的人工启动子Om35S片段，将其克隆入载体pSAU2006中获得与GUS基因编码区以及Tons终止子融合的中间载体pU—Om35Sgus；通过限制性酶切下“Om35S-Gus”片段并将其插入植物表达载体pVCT2020中，获得含“Om35S-GUS-Tnos”表达盒的植物表达载体pC-Om35Sgus；采用冻融法将该表达载体导入根癌农杆菌EHA105中，经农杆菌介导转化烟草叶片细胞，以组织化学法分析GUS基因的瞬间表达活性。结果显示：转Om35S-GUS基因的烟草叶片材料中，在不加四环素及正常组培条件处理下没有检测到GUS活性，表明Om35S人工杂合启动子为具有表达严紧性。 2．将N端缺失而自＃157、＃238、＃273和＃404位氨基酸残基开始保留的拟南芥热激因子AtHSFlα的C端的编码基因序列，分别与四环素阻遏蛋白基因tetR相拼接，获得融合基因RHSFC157、RHSFC238、RHSFC273、RHSFC404并克隆入载体pSAU2006中，分别构建了由35S启动子控制融合基因的四种中间载体p35S-RHSFC157、p35S-RHSFC238、p35S-RHSFC273、p35S-RHSFC404；通过限制性酶分别酶切四种载体获得“35S-RHSFC157-Tnos”、“35S-RHSFC238-Tnos”、“35S-RHSFC273-Tnos”和“35S-RHSFC404-Tnos”四种表达盒基因片段；另外通过限制性酶酶切pU-Om35Sgus载体获得“Om35S-Gus”片段，将该片段分别与上述四种表达盒片段之一共同重组进表达载体pVCT2020中，获得四种四环素调控系统35SC157-Orn35Sgus、35SC238-Om35Sgus、35SC273-Om35Sgus和35SC404-Om35Sgus。采用冻融法将构建的四种表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105中，并经农杆菌介导转化烟草叶片细胞，以组织化学法分析GUS基因的瞬间表达活性。结果显示：在35℃且不加四环素时，均能检测到较强的GUS基因表达活性，而在加入1mg/L四环素处理下GUS基因表达活性均受到抑制。表明这四种调控系统均具有功能且严格受四环素负调控。 3．将调控系统35SC157-Om35Sgus中控制调节组分的35S启动子替换成HSP70m人工热激启动子，获得一新型的、由热激与四环素双重诱导调控的植物基因表达调控系统70mC157-Om35Sgus。同样进行瞬间表达分析该系统功能，结果显示：(1)在25℃以下及不加四环素处理下均没有检测到GUS活性：在28℃以上不加四环素处理下均检测到了GUS活性。其中，28℃表达最弱，35℃时表达活性最强。而在加入1.0mg/L四环素以及35℃培养下没有检测到GUuS表达活性。另外，对GUS表达活性最强的烟草叶片采用1.0mg/L四环素处理不同时间，4小时后没有检测到GUS表达活性。表明植物基因表达调控系统70mC157-Orn35Sgus严格受温度和四环素的调控，并且诱导效应相当灵敏。

目录

文摘

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第1章文献综述

1.1植物基因工程中诱导表达系统研究概况

1.2四环素调控系统的研究进展

1.3热激系统研究进展

第2章绪论

2.1研究目的和意义

2.2研究的内容

2.3论文新意

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.2实验方法

第4章实验结果与分析

4.1四环素阻遏蛋白-热激因子融合转录因子的编码基因的合成

4.2人工杂合启动子Om35S的合成与功能鉴定

4.3四环素诱导调控系统的构建与功能鉴定

4.4热激和四环素双重诱导调控系统的构建与功能鉴定

第5章讨论

第6章结论

参考文献

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