应用DGGE技术分析常用消毒液对猪皮肤微生物区系的影响

摘要

背景 生物敷料已经成为现代烧伤治疗中的重要方法，由于新鲜异体皮肤具有很多理想烧伤敷料的特性，被认为是作为临时覆盖皮肤的最佳选择。尽管供体不足的现象比较严重，在过去及其现在，多种动物皮肤用作生物敷料。从20世纪60年代开始，猪皮肤成为应用最广泛的异种移植物。它的主要优势是来源广、储存、消毒都很方便，且猪皮的胶原组织结构、胶原含量、粘附性等方面与人皮基本一致，与人体的相容性好。和同种异体皮比较，粘附、止血、缓解疼痛的作用几乎完全相等。异种皮肤作为一种生物敷料，它通过防护液体流失，控制细菌侵入，促进植皮区域深层肉牙组织形成，对病人提供短暂的保护。但是，在使用大量的异种皮时，尽管已经进行了一些消毒处理，还是有一些供体皮肤细菌在病人皮肤定居，甚至一些致病菌引起伤口的感染。因此，异种皮肤的消毒抗菌处理在异种移植时非常重要。 由于传统的微生物技术只能分析可培养的微生物，在研究微生物生态系统时难免存在不可逾越的缺陷和不足。所以，要准确评价消毒液对皮肤菌群的作用还需其它方法的补充。基于16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel dectrophoresis，DGGE)技术具有直观、快速和高通量的优点，能有效反映复杂微生物区系全貌，适合于分析复杂的微生物菌群，而且目前已被应用于皮肤微生态相关研究。 研究目的和意义为了解传统的消毒抗菌处理对异体皮细菌的影响，了解异种移植猪皮肤的细菌情况，从而优化消毒步骤，更彻底的除去异种移植用猪皮肤的细菌。因此，研究异种移植猪皮肤消毒后活菌的种属，对于确定消毒处理的有效性，保证使用异种移植产品的质量，是完全必要的。了解常用消毒液的消毒抗菌处理对猪皮肤细菌的影响，为了更有效制备和临床使用异种移植猪皮提供背景资料，本实验对其进行了研究。 研究方法： (1)利用PCR-DGGE技术分析酒精、碘伏、新洁尔灭、庆大霉素处理对猪皮肤优势细菌的影响。 (2)利用16S rDNA克隆建库结合测序技术分析不同消毒液连续消毒后猪皮片细菌区系组成。 研究结果 1.三种消毒液及庆大霉素对猪皮肤微生物区系影响： 在不同消毒剂和不同时间对猪皮肤消毒处理对猪皮肤细菌种类和多样性研究中发现，有效碘含量5％聚维酮碘5分钟消毒对猪皮肤细菌种类和多样性的影响最为显著，即对猪皮肤细菌种类的减少最有效果。 2.三种消毒液及庆大连续消毒猪皮肤后皮肤细菌区系16SrDNA序列分析： 三种消毒液和庆大霉素连续消毒猪皮肤后，猪皮肤细菌区系存在的优势菌株为葡萄球菌(Staphylococcus)、苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum strain)、撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)。还有少量的猪粪细菌(Swine manure pit bacterium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)。 3.16S rDNA基因序列分析和DGGE技术在细菌区系分析中的应用构建16S rDNA文库与PCR-DGGE相结合分子生物学方法，在微生物多样性研究中不仅展示了群落微生物的多样性，而且还可以检测显示微生物基因组DNA信息，在简单的微生态系统多样性细菌鉴定方面具有快速，简捷等优点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

声明

文献综述

1.猪皮作为异种移植物在烧伤治疗中的应用

2.皮肤微生物的分子微生态学分析

2.1基于PCR技术的DNA指纹图谱技术

2.2荧光原位杂交技术(FISH)

2.3 16S rDNA文库的构建与组成分析

2.4.DGGE的发展和基本原理

论文正文

1.前言

2.材料

2.1实验动物

2.2主要式剂

2.3主要仪器设备

2.4主要溶液及试剂配制

3方法

3.1取皮

3.2实验分组

3.3细菌的培养

3.4细菌DNA的提取

3.5PCR的扩增

3.6 DGGE分析

3.7 16SrRNA克隆文库

3.8阳性克隆序列分析及其系统树的建立

4.结果

4.1猪皮肤细菌总DNA的抽提

4.2 16S rDNA全长扩增及其可变区V3区扩增

4.3 PCR-DGGE分析常用消毒液对猪皮肤微生物区系组成的影响

4.4连续消毒组细菌区系16Sr DNA文库建立和序列分析

5.讨论

5.1消毒液及抗生素对猪皮肤细菌的影响

5.2消毒剂连续处理组猪皮肤的细菌学分析

5.3 16SrRNA基因序列分析和DGGE技术在细菌区系分析中的应用

6.全文小结

参考文献

致谢