家蚕第14连锁群4个标记基因的SSR分子标记定位研究

摘要

家蚕作为鳞翅目的代表昆虫，又是遗传学研究的极好材料。在数千年的养蚕历史中，因自然选择和人工诱发，有着丰富的遗传突变。家蚕连锁遗传图谱研究历经百年，已将300多个突变基因定位在分布于28个连锁群的220多个基因位点上。随着DNA分子标记技术的发展和在家蚕研究中的应用，家蚕分子连锁图谱研究取得丰硕成果，先后构建了RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP分子标记图谱。但是家蚕经典连锁图与分子标记连锁图之间仍然处于孤立的状态，使这些成果的应用受到限制。因此，家蚕分子连锁图谱和经典遗传图谱的整合成为目前家蚕遗传学的重要课题和研究热点。 家蚕SSR分子连锁图的发表以及SSR分子标记技术的诸多优点为家蚕分子连锁图谱和经典遗传图谱的整合创造了成熟的条件。本研究利用家蚕SSR分子连锁图的分子标记对经典遗传图谱第14连锁群的4个标记基因U、Nd-s、Di、oa进行了定位研究，研究内容和结果如下： (1)所采用的作图群体是回交群体：以F1雌回交隐形亲本的回交群体(BC1F)和以F1雄回交隐形亲本的回交群体(BC1M)。BC1F群体用于标记的筛选与连锁关系的确定，BC1M群体用于对标记进行基因型分析，以计算标记基因间与SSR标记间的遗传重组率，确定它们之间的遗传距离。配制作图群体的材料：选用西南大学家蚕基因资源库的基因定位系统17-141 U·Nd-s和近交系“大造”配制U和Nd-s基因的连锁分析组合和定位分析组合；选用17-142 oa和09-500Di配制Di和oa基因的连锁分析组合和定位分析组合。 (2)用与家蚕SSR连锁图谱对应于14连锁群的26对SSR引物在亲本17-141U·Nd-s和“人造”之间进行多态性筛选，找剑了9对在两个亲本间表现多态性的引物，再用这9对引物对连锁分析组合BC1F群体的22个个体(11个表现丝胶茧性状的个体和11个正常个体)和2个亲本，共24个个体基因组DNA进行PCR扩增和PAGE电泳检测，筛选到4对与标记基因U和Nd-s连锁的SSR标记：S1401、S1411、S1419、S1426。用这4对SSR标记对U和Nd-s突变基因的定位分析组合BC1M群体的110个个体基因组DNA进行SSR-PCR分析，经过数据统计和分析，利用作图软件得到U、Nd-s标记基因和与它们连锁的4个SSR标记的连锁图，该连锁图总图距为50.4cM，与U基因最近的标记是S1411，距U基因0.9cM，距离Nd-s最近的标记是S1419，距Nd-s基因0.0cM。 (3)同样用这26对SSR引物在杂交组合的亲本17-142 oa和09-500Di间进行多态筛选，得到8对在两个亲本间表现多态性的标记。通过用这8对SSR标记在BGF群体中进行连锁检测，也找到了4对与标记基因Di和oa连锁的标记：S1414、S1418、S1419、S1926(其中有两个标记S1419和S1426也和标记基因U、Nd-s连锁)。用这4对标记对Di和oa的定位分析组合BC1M群体的145个个体基因组DNA进行SSR-PCR分析，经过数据统计和分析，利用作图软件得到Di和oa标记基因和与它们连锁的4个SSR标记的连锁图，该连锁图总图距为55.8cM，距离oa最近的标记是S1414，距oa基因13.1cM。 (4)利用作图软件对两次实验得到的两张连锁图进行整合，将4个标记基因和与它们连锁的6个SSR标记整合在一张连锁图谱上，其中SSR标记S1411与标记基因U图距为0.9cM，SSR标记S1419与标记基因Nd-s的图距为0.6cM。这张整合图谱上4个基因之间的排列顺序与经典连锁图谱14连锁群完全一致，遗传距离也基本一致。我们的研究结果表明，完全可以通过多次实验，全面整合家蚕经典连锁图和分子连锁图的各连锁群。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1分子标记的研究进展

1.1.1限制性片段长度多态性

1.1.2随机扩增多态性DNA

1.1.3选择性扩增片段长度多态性

1.1.4简单序列重复多态性

1.1.5单链构象多态性

1.1.6酶切扩增多态性序列

1.1.7单核苷酸多态性

1.2研究分子标记的目的和意义

1.2.1遗传多样性和种质鉴定

1.2.2分子标记辅助育种

1.2.3构建分子连锁图谱

1.2.4定位重要经济性状基因

1.3家蚕分子标记基因定位的研究进展

1.3.1家蚕RAPD的基因定位研究

1.3.2家蚕AFLP的基因定位研究

1.3.3家蚕QTL的基因定位研究

1.3.4家蚕SSR的基因定位研究

第二章引言

2.1研究背景和意义

2.2研究内容

2.3技术路线

第三章材料与方法

3.1材料

3.1.1家蚕突变基因系统

3.1.2杂交组合材料

3.1.3引物

3.1.4主要试剂

3.1.5常用溶液的配制

3.1.6主要仪器设备

3.2研究方法

3.2.1基因组DNA的提取

3.2.2模板DNA的制备

3.2.3 SSR标记与突变基因的连锁分析

3.2.4定位分析方法

3.2.5 PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.6数据分析方法

第四章结果与分析

4.1家蚕基因组模板DNA的制备

4.2扩增产物的琼脂糖电泳检测

4.3家蚕突变基因U、Nd-s的定位

4.3.1亲本17-142和“大造”间的多态筛选

4.3.2与U、Nd-s连锁的SSR标记的验证

4.3.3 U、Nd-s突变基因的定位

4.4家蚕突变基因Di、oa的定位

4.4.1亲本17-142和09-500间的多态筛选

4.4.2与Di、oa连锁SSR标记的验证

4.4.3 Di、oa突变基因的定位

4.5 U、Nd-s连锁图和Di、oa连锁图的整合

第五章讨论

5.1家蚕基因定位方法的发展

5.2家蚕SSR分子标记基因定位的实验体系

5.2.1作图群体的选择

5.2.2 SSR分子标记

5.2.3作图软件的选择

5.2.4 SSR图谱与经典连锁图的比较

5.3研究结果的意义

第六章结论

参考文献

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢