应用体内诱导抗原技术筛选仔猪大肠杆菌0139体内表达基因的初步研究

摘要

猪致病性大肠杆菌病是对规模化养猪生产危害较严重的传染性疾病之一，给养猪业带来巨大经济损失。一方面，大肠杆菌的血清型复杂，致病性大肠杆菌血清型不断发生变化，导致免疫失败，给猪大肠杆菌病的控制增加了困难。另一方面，由于近年来抗生素的广泛持续利不当使用，导致大肠杆菌耐药株的不断增多，耐药机制的不断变迁，使人们对大肠杆菌病的治疗变得十分困难。因此，本研究拟利用体内诱导抗原技术，希望找到一些大肠杆菌的体内诱导基因，并分析它们的功能，从而能进一步了解大肠杆菌病的具体致病机制，为将来发现新的药物靶标，研发新的疫苗和诊断试剂提供一些新的线索。 体内诱导抗原技术(in vivo—induced antigen technology，IVIAT)是快速鉴定体内特异性表达抗原基因的高通量筛检技术。其原理是利用体外培养的病原微生物去除感染动物血清中针对体外表达抗原的抗体，再用此吸附血清作为探针来筛选病原微生物基因组表达文库中体内特异性表达抗原的基因，旨在为新药、新疫苗利新型诊断方法研发提供新靶标，为进一步阐明病原体致病与免疫机理提供理论依据。 病原菌感染机体后体内诱导表达的抗原通常与病原菌的致病性机制密切相关。为了研究致病性大肠杆菌感染机体过程中存在的致病因子，本研究采用了体内诱导抗原技术，以致病性大肠杆菌O139为研究对象，对其在体内的表达基因进行了筛选。 首先构建了猪源大肠杆菌O139的基因组表达文库：提取了猪源大肠杆菌O139的基因组，用限制性内切酶Sau3AI不完全酶切并回收1～4Kb的基因组DNA片段。限制性内切酶BamHI酶切原核表达载体pET-32a(+)，回收线性载体，用CIAP去磷酸化。将上述两种酶切回收DNA片段进行连接反应，转化大肠杆菌DH5a，碱裂解法提取重组质粒，用 XhoI和 NcoI双酶切的方法对提取的重组质粒进行鉴定，鉴定结果达到符合要求。把大量提取的重组质粒直接转入新鲜制备的感受态细胞BL21中，计算表达文库的库容量，经过计算文库容量为1.2×104，满足了我们研究工作的需要，之后随机挑取10个克隆用上述双酶切方法鉴定文库．结果显示随机挑选的10个克隆都为阳性克隆，酶切后载体片段约为5.9Kb，插入片段基本位于2～4Kb之间。说明大肠杆菌基因组O139的表达文库构建的比较成功，为进一步筛选大肠杆曲体内诱导基因奠定了良好的基础。 然后对大肠杆菌基因组表达文库进行了筛选：收集感染致病性大肠杆菌仔猪的血清，用玻板凝集法检测仔猪血清抗体，比较符合率，符合率为30％(3/10)，与菌株血清型鉴定一致。用经体外培养的大肠杆菌菌株O139和BL21(含pET-32a(+)空载体)的超声产物吸附仔猪血清，ELISA方法确定血清的最佳稀释倍数及测定吸附后血清抗体滴度变化，根据最佳抗体浓度采用菌落原位免疫的方法对表达文库进行免疫筛选，寻找阳性克隆。但是，筛选结果没有得到阳性克隆，其原因有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章文献综述

1.1概述

1.2大肠杆菌的抗原特性

1.3致病力与毒力因子

1.3.1黏附素

1.3.2肠毒素

1.3.3外膜蛋白

1.3.4溶血素

1.4猪大肠杆菌病

1.4.1仔猪黄白痢

1.4.2断奶仔猪腹泻

1.4.3断奶仔猪水肿病

1.4.4致病机理

1.5体内诱导抗原技术

第2章仔猪大肠杆菌O139基因组表达文库的构建

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2实验动物

2.1.3大肠杆菌O抗原定型血清诊断液

2.1.4微量生化鉴定管

2.2工具酶及主要试剂

2.2.1工具酶

2.2.2主要试剂

2.2.3主要试剂的配制

2.2.4主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1样本采集

2.2.2大肠杆菌的分离鉴定

2.2.3仔猪大肠杆菌O139的培养及其染色体基因组的提取

2.2.4限制性内切酶Sau3AI的最佳酶切浓度的确定

2.2.5宝生物TaKaRa公司试剂盒回收DNA

2.2.6 pET-32a(+)质粒载体连接位点的暴露和去磷酸化

2.2.7 DNA的连接

2.2.8感受态细胞的制备及重组DNA转化

2.2.9碱变性法提取质粒

2.2.10重组质粒的鉴定

2.2.11表达文库的构建和质量鉴定

2.3实验结果

2.3.1待检菌株的鉴定结果

2.3.1文库载体的制备

2.3.2仔猪大肠杆菌O139基因组DNA的提取

2.3.3仔猪大肠杆菌O139基因组DNA部分酶切

2.3.4仔猪大肠杆菌O139基因组表达文库的构建和质量鉴定

2.4讨论

第3章仔猪大肠杆菌O139体内诱导基因的筛选

3.1实验材料和试剂

3.1.1实验材料

3.1.2主要试剂和溶液

3.1.3主要仪器和设备

3.2实验方法

3.2.1玻片凝集检测血清抗体

3.2.2去除抗血清中交叉反应的抗体

3.2.3血清最佳稀释倍数的确定及吸附后血清抗体滴度的测定

3.2.4 E.coli O139基因组表达文库的筛选

3.3实验结果

3.3.1血清抗体的检测

3.3.2血清的吸附处理

3.3.3 E.coli O139基因组表达文库的筛选

3.4讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文