人类青少年视网膜黄斑退化疾病基因的研究

摘要

眼睛是人类的重要器官之一，负责收集外界信息，并通过其视网膜将收集到的信息传入大脑形成视觉。人类眼睛的工作原理与相机照相类似：用相机照相时，被照相物体通过光线进入相机的镜头，然后在胶卷底片上成像；同样，外界物体光线通过人类眼睛的角膜、晶状体在视网膜成像，并通过视神经将所获得的图像信息传入大脑形成视觉。视网膜是人类形成视觉的最关键部分，是一层很薄的软组织，分为边缘区和中央区，正中央区称为黄斑区。视网膜的退化或萎缩会导致视力的下降，甚至失明；视网膜黄斑区的退化或萎缩称为视网膜黄斑退化，如果在青少年时期以前发病被称为青少年视网膜黄斑退化，如果在老年时期发病则被称为老年黄斑变性。人类青少年视网膜黄斑退化主要是由于调控视网膜发育或维持视网膜正常功能的基因突变所致。到目前为止，青少年视网膜黄斑退化无有效的早期诊断、治疗和预防方法，因此，人类青少年视网膜黄斑退化疾病基因的克隆和突变位点的鉴定是其致病机制研究的关键，是解决此类疾病早期诊断、治疗和预防的基础。本研究主要收集人类青少年视网膜黄斑退化家系，基于人类基因组计划的研究成果，采用遗传连锁分析，基因克隆和序列分析，研究人类青少年视网膜黄斑退化疾病位点/基因。获得的主要研究结果如下： 1．人类青少年视网膜黄斑退化家系的收集 人类青少年视网膜黄斑退化疾病属于单基因疾病。定位克隆法是克隆单基因疾病基因的强有力方法，单基因疾病基因的定位克隆主要是同过家系的遗传连锁分析来完成的，因此，家系的收集、尤其是大家系的收集是发现单基因疾病基因/位点和致病突变的关键。在家系收集时，表型的确定（疾病的确诊）很重要，因为错误的表型会导致发现错误的疾病基因连锁位点或找不到真正的疾病基因连锁位点。本研究收集了2个青少年黄斑退化大家系，并进行了临床表型特征和遗传特征的研究。 2．相关青少年视网膜黄斑退化家系的遗传连锁分析和疾病基因的定位 对于青少年视网膜黄斑退化家系的疾病基因克隆，首先是疾病基因的定位：包括已知黄斑退化疾病基因位点的确定和新疾病基因位点的鉴定。 （1）通过用基因型分析和基因编码区序列分析鉴定已知疾病基因位点/基因和突变。 Bardet-Biedl综合征（BBS）是一个有多个器官缺陷的人类常染色体隐性遗传性疾病，其中视网膜退化是最主要的表型之一。对收集的一个中国人Bardet-Biedl综合征（BBS）近亲结婚人家系（家系972）进行详细临床检查，从血液样品中获得DNA。然后用人类染色体上短重复片段遗传标记物（STR Markers）对已知BBS13个位点/14个基因进行了疾病基因连锁分析，发现了该家系的疾病基因连锁到BBS7/BBSl2基因位点。进一步的BBS7和BBSl2基因外显子序列分析发现了该家系的疾病由BBS7S556R突变所致。这是第一个中国人BBS疾病基因研究的报道，并发现了BBS7的1个新突变。 （2）全基因组扫描发现视网膜黄斑退化疾病基因阳性位点 已有部分青少年视网膜黄斑退化的疾病基因被克隆，但在中国还未有青少年视网膜黄斑退化的疾病基因被克隆的报道。收集到1个包括18个患者共43人的常染色体显性遗传青少年视网膜退化大家系（1085家系）。该家系患者的临床症状较为特别，以黄斑退化和视网膜色素变性同时发生为特征。先用人类染色体上短重复片段遗传标记物（STR Markers）对已知青少年视网膜退化位点进行了连锁分析。在排除该家系与已知视网膜疾病基因位点连锁后，用美国Illumina公司The HumanLinkage-12磁珠芯片（6090SNP（单核苷酸多态性）标记物）全基因扫描新技术，采用该公司推荐的标准方法进行人类染色体的全基因组遗传连锁扫描。将全基因组扫描所得信息计算Lod Score（表示疾病基因与标记物连锁的可能性），用Lod Score值来判断SNP与疾病基因的距离。对已完成扫描的这个青少年黄斑退化家系结果分析完后，确定了可能的阳性位点。 3．青少年视网膜退化家系疾病基因新位点的确认和最小遗传间距的确定 一旦全基因遗传连锁分析完成后，可能会有多个可能的阳性位点，下面的任务就是进行单倍体型分析和使用更多更精细的STR标记物或单核苷酸多态性标记物或增加更多病人样本来确定和缩小最小遗传间距（MGI）。这是最终疾病基因鉴定的前提。通过单倍体型分析初步判定该家系的疾病基因位点位于7p21。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述 人类青少年视网膜黄斑退化疾病基因研究进展

1.1 概述

1.2常染色体隐性遗传性青少年黄斑退化-Stargardt病和眼底黄色斑点病

1.2.1 STGD的遗传学研究

1.2.2 ABCA4(ATP—binding cassette，sub—family member 4)

1.2.3 ABCA4小鼠动物模型

1.3常染色体显性遗传性青少年黄斑退化

1.3.1常染色体显性Stargardt样黄斑变性

1.3.2 RDS(Peripherin／Retinal degeneration，slow，)突变引起的黄斑变性

1.3.3Best病或卵黄形黄斑退化(Vitelliform macular dystrophy)

1.3.4 Doyne蜂窝状视网膜萎缩(Doyne honeycomb retinaldystrophy，DHRD)：(malattia Laventinese(MLVT)常染色体显性玻璃疣)

1.3.5 Sorsby眼底退化病(Sorsby fundus dystrophy，SFD)

1.3.6北卡林罗纳黄斑退化(North Carolina Macular Dystrophy，NCMD)

1.3.7进行性双焦性脉络膜-视网膜萎缩 (Progressive bifocal chorioretinal atrophy，PBCRA)

1.3.8显性囊性黄斑退化(dominant cystoid macular dystrophy，DCMD)或显性囊性黄斑水肿(dominant cystoid macular oedema)

1.3.9其它已定位但基因还未克隆的青少年视网膜黄斑退化的疾病基因位点

1.4 X l i nked遗传型黄斑变性

1.4.1 X连锁青少年视网膜霹雳(X linked juveni le retinoschisis，XLRS)

1.5 Bardet—Biedl综合征(Bardet—Biedl Syndrome，BBS)

第二章 引言

2.1青少年黄斑退化疾病基因及突变鉴定的重要意义

2.2技术路线

2.2.1 青少年黄斑退化疾病基因及突变鉴定的技术路线

2.2.2已知疾病基因位点分析，用基因型分析方法和已知基因编码区序的方法检查是否为己知疾病基因位点或基因

2.2.3全基因组扫描寻找新的疾病基因位点

2.2.4青少年视网膜退化家系疾病基因新位点的确认和最小遗传间距的确定

第三章 中国人Bardet—Biedl综合征家系BBS7基因新突变的鉴定

3.1材料和方法

3.1.1家系来源

3.1.2知情同意书

3.1.3病人检查设备

3.1.4血液标本的收集(每个参与者10毫升)

3.1.5主要试剂及耗材

3.1.6实验主要仪器

3.1.7实验主要试剂配制

3.1.8 DNA提取

3.1.9遗传连锁分析

3.1.10突变的筛选

3.2结果与分析

3.2.1临床发现

3.2.2已知BBS位点基因型分析结果

3.2.3 BBS7和BBSl2基因外显子测序分析结果

3.3讨论

第四章青少年黄斑退化疾病基因新位点的定位

4.1材料和方法

4.1.1家系来源

4.1.2知情同意书

4.1.3病人检查设备

4.1.4血液标本的收集(每个参与者10毫升)

4.1.5实验主要试剂及耗材

4.1.6实验主要仪器

4.1.7主要溶液及配制

4.1.8 DNA提取

4.1.9遗传连锁分析

4.1.10 Illumina HumanLinkage—12磁珠全基因全基因扫描结果的遗传连锁分析

4.1.11全基因扫描的遗传连锁分析

4.2结果与分析

4.2.1临床发现

4.2.2 已知位点疾病基因的排除

4.2.3全基因组扫描遗传连锁分析结果

4.2.4青少年黄斑退化位点最小遗传距离的确定

4.3讨论

第五章结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及参与研究的课题情况论文目录

参志研究的课题

致谢