转反义NR基因四倍体金鱼草(Antirrhinum majus)的培育

摘要

植物体内乙烯生理作用的发挥是通过乙烯生物合成途径及乙烯信号转导途径来实现的。NR基因是与ETR1基因同源的乙烯受体蛋白基因，它对乙烯的接收和信号的转导直接影响着植株的生理和生长，影响着植物的抗逆性。NR基因不仅调控果实的成熟，而且还与植株的其他生理代谢，生长发育有密切的关系。通过转反义NR基因植株的获得，可以研究NR基因与植株的生理代谢，植株生长、发育和果实成熟等之间的关系，鉴定NR基因的作用；还能获得可用于生产实践的耐贮藏、抗性强的新品种或育种材料。 金鱼草(Antirrhinum majus)为玄参科多年生草本花卉。其品种多，花色丰富而艳丽，花期长，是花坛、花境及切花的常用素材。近年来，金鱼草已成为遗传学和分子生物学、特别是转座子、花色素发育与调控和花型发育研究的重要经典材料。 金鱼草基因转化报道还较少，由于金鱼草的无菌苗生长势极弱，从而导致以下胚轴为外植体进行农杆菌Ti质粒介导法进行基因转化时，因下胚轴太小太细，再加上农杆菌的侵染作用，外植体在共培养阶段几乎全部死亡，从而使再生率和转化率大大下降，为金鱼草的基因转化工作增加难度。 本研究结合了多倍体诱导和转基因工程两种技术，在基因转化前采用培养基中加秋水仙素法进行金鱼草多倍体的诱导，得到直径粗于金鱼草种子苗下胚轴几倍的四倍体再生苗；外源基因的转化采用根癌农杆菌携带反义NR基因与金鱼草四倍体再生苗的茎段共培养，将反义NR外源基因导入金鱼草细胞的染色体组，并通过不定芽进行抗性标记的筛选，对部分转基因四倍体进行PCR、Southern和Northern检测，成功获得抗卡那霉素的四倍体金鱼草植株。论文的研究结果如下： 1、以市场所售的二倍体(2n=2x=16)切花金鱼草品种为材料，获得金鱼草的壮苗培养基的配方为1/2MS+BA1 mg/L+IAA0.2 mg/L；幼嫩茎段的分化培养基为MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L；生根培养基的配方为：1/2MS+IBA0.5 mg/L。 2、金鱼草四倍体的诱导采用培养基中加秋水仙素法，诱导浓度和时间分别是0.1％、4 d；对部分突变体进行PCR检测和染色体倍性鉴定，表明四倍体金鱼草诱导成功。经反复继代筛选，分离出同质的四倍体金鱼草。 3、首次将反义NR基因导入四倍体金鱼草，并获得了部分转基因突变体。其转化体系如下：以四倍体金鱼草的幼嫩茎段为外植体，用OD550值为0.4的农杆菌浸染，转入不含卡那霉素压力再生培养基上黑暗共培养2 d后，再转入含卡那霉素压力的筛选培养基(MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L+卡那霉素50 mg/L+羧苄青霉素500 mg/L)，通过压力筛选获得的抗性株为转基因四倍体金鱼草植株。 4、对转化苗进行PCR检测，扩增出一条特异的电泳带，该片段为35S启动子的保守序列，由此表明外源基因已经整合到金鱼草细胞中；Southern检测了部分转基因四倍体，35S启动子DNA和转化植株DNA均有杂交信号，而术转化植株的DNA无杂交信号，证明NR基因已被成功转入到金鱼草细胞中；Northern检测了部分转基因四倍体，转化株的mRNA比非转基因植株的表达量弱，证明反义NR基因在转基因植株中与植株得到有效表达。 5、对转化株与非转化株的花期进行统计，非转基因植株的花期为15-20 d，瓶插保鲜期为5-6 d，转基因植株花期为25-30 d，瓶插保鲜期为10-12d，表明反义NR基因的转入能够延长金鱼草的鲜花保鲜期。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1植物组织培养

1.2植物多倍体育种的研究进展

1.3转基因育种的研究进展

1.4花卉基因工程研究现状

1.5花卉切花保鲜技术研究进展

1.6 NR基因

第2章 引言

2.1金鱼草生产现状

2.2金鱼草的育种现状

第3章金鱼草四倍体的诱导、筛选及鉴定

3.1试验材料与方法

3.2金鱼草四倍体的鉴定

3.3四倍体的稳定性分析

3.4试验结果与分析

第4章 四倍体金鱼草反义NR基因的转化、筛选、表达及鉴定

4.1试验材料

4.2四倍体金鱼草NR基因的转化

4.3试验结果与分析

第5章讨论

5.1不同组织部位影响外植体再生率的讨论

5.2培养基成分对金鱼草组培苗生长势的影响

5.3对金鱼草进行壮苗培养的必要性

5.4四倍体金鱼草的性状表现

5.5秋水仙素浸泡法与培养基中加秋水仙索诱导法的比较

5.6农杆菌浓度对转化率的影响

5.7乙酰丁香酮在转化中的作用

5.8预培养与转化的关系

第6章结论

6.1金鱼草再生体系的建立

6.2金鱼草四倍体的诱导与检测

6.3四倍体金鱼草NR基因的转化

6.4转NR基因四倍体金鱼草转化株的鉴定

6.5实验中存在的问题

参考文献

附图

致谢

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