蜂蜡素降低血浆胆固醇作用机制的研究（三）

摘要

【目的】 1．制备无脂血清，为蜂蜡素降低血浆胆固醇作用机制的研究提供有利的实验条件。 2．观察蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对人体外肝癌细胞系HepG<,2>细胞胆固醇生物合成关键酶HMG-CoA 还原酶合成、降解以及细胞总蛋白的影响，以期在体外细胞蛋白水平上阐明蜂蜡素降低血浆胆固醇与HMG-CoA 还原酶的关系，以及相关作用机制，进一步明确蜂蜡素降低血浆胆固醇的作用位点及发掘蜂蜡素降血脂的作用特点。 3．比较蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶 HMG-CoA 还原酶合成、降解和对细胞总蛋白的影响，以明确蜂蜡素降低血浆胆固醇的主要有效成分，为蜂蜡素原料提取工艺改革和组分优化提供依据。 【方法】 1、实验用无脂血清(LPDs)的制备 采用角度转头和一次性梯度超速离心法，将正常人血清中 VLDL、LDL、HDL 等脂蛋白与无脂血清(LPDS)分离；用琼脂糖凝胶电泳法对无脂血清蛋白质分子量进行鉴定。 2、蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶HMG-CoA还原酶合成和降解的影响 应用同位素示踪技术、免疫沉淀法和SDS-PAGE 电泳检测 HepG<,2> 细胞HMG-CoA 还原酶蛋白质水平，图像分析系统检测 HepG<,2>细胞HMG-CoA还原酶蛋白积分光密度，通过积分光密度值判断不同浓度蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG<,2>细胞HMG-CoA 还原酶合成和降解速率的影响。 3、蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对人HepG<,2>细胞总蛋白的影响 同位素示踪技术和液体闪烁计数技术检测HepG<,2>细胞总蛋白水平，通过TCA 沉淀标记物与总放射性活性的比值判断不同浓度蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG<,2>细胞总蛋白的影响。 资料统计应用 PEMS 3.1统计分析软件。数据以样本均数±标准差表示。统计学差异采用 t 检验分析，P<0.05表示两组差别有显著意义；P<0.01 表示两组差别有非常显著意义。 【结果】 1、实验用无脂血清(LPDS)的制备 制备无脂血清的实验显示，对正常人血清离心结束后可见离心管中明显分层，最下层为脱脂血清；对分离的人无脂血清与正常人血清同时进行琼脂糖凝胶电泳，可见正常人血清脂蛋白分成三个区带，而分离的无脂血清没有任何区带出现，脂染色呈阴性。 2、蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶 HMG-CoA 还原酶合成和降解的影响 2.1 蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶 HMG-COA 还原酶合成的影响 〔<'35>S〕蛋氨酸同位素示踪、免疫沉淀、SDS-PAGE电泳和荧光X线照相术实验结果显示，随着时间增长，蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇蛋白条带变化不明显，图像分析结果显示，HMG-COA 还原酶蛋白质积分光密度仅轻度升高，但与同时间点溶剂对照组比较，P值均<0.01，差别有非常显著意义。结果表明，三药可明显抑制HMG-CoA 还原酶蛋白质合成，三药作用强度基本相似。 2.2 蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶 HMG-CoA 还原酶降解的影响 〔<'35>S〕蛋氨酸同位素示踪、免疫沉淀、SDS-PAGE电泳和荧光X线照相术实验结果显示，随着时间增长，蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇高、中、低三个剂量组蛋白条带逐渐变细，图像分析结果显示：HMG-CoA 还原酶蛋白质积分光密度逐渐降低，呈明显的指数衰减关系，各给药组和溶剂对照组比较，P值均<0.01，差别有非常显著意义。三药T<,1/2>比溶剂对照组分别缩短3.12～3.59倍。结果表明，三药均可明显抑制HMG-CoA还原酶蛋白质降解，三药缩短T<,1/2>的顺序依次为：二十八烷醇>三十烷醇>蜂蜡素。 3、蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对人HepG<,2>细胞总蛋白的影响 〔<'35>S〕蛋氨酸同位素示踪技术和液体闪烁计数实验结果显示，在0—40min之间，蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇可使细胞总蛋白放射活性(CPMA)/上清液总放射活性(CPMA)的比值仅轻微升高，但与同时间点溶剂对照组比较(20min和40min)，P值均<0.01或<0.05，差别有非常显著意义或显著意义。 结果表明：蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇对细胞总蛋白合成有一定的抑制作用，三药作用强度基本相似。三药对HMG-CoA还原酶蛋白质合成抑制作用强于对细胞总蛋白合成抑制作用。 在0h-3h之间，蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇可使细胞总蛋白放射活性(CPMA)/上清液总放射活性(CPMA)的比值逐渐减小，与溶剂对照组比较，P值均<0.01 或 <0.05，差别有非常显著意义或显著意义。蜂蜡素、三十烷醇和二十八烷醇三药T<,1/2>数值基本接近。结果表明，三药对细胞总蛋白降解有明显的抑制作用，二十八烷醇缩短T<,1/2>较前两者明显，蜂蜡素和三十烷醇对T<,1/2>影响基本相当。三药促进HMG-CoA还原酶蛋白降解作用强于对细胞总蛋白降解的影响。 【结论】 1．利用一次性密度超速离心分离人血清脂蛋白可以获得高纯度的无脂血清(LPDS)，为蜂蜡素降低血浆胆固醇作用机制研究提供了有利条件。 2．蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇能明显抑制HepG<,2>细胞HMG-CoA 还原酶蛋白质合成。 3．蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇能明显促进HepG<,2>细胞HMG-CoA 还原酶蛋白质降解。 4．蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对HepG<,2>细胞总蛋白合成有一定的抑制作用并促进其降解。 5．三十烷醇和二十八烷醇对HMG-CoA 还原酶蛋白质合成和降解，以及对细胞总蛋白合成和降解的影响与蜂蜡素相同，两药均为蜂蜡素降低血浆胆固醇的有效成份。三药对HMG-CoA还原酶蛋白质合成作用强度基本相当，但对HMG-CoA还原酶蛋白质降解作用强度则二十八烷醇>三十烷醇>蜂蜡素。

目录

声明

前言

1.研究背景

2研究目的

3研究内容

第一部分实验用无脂血清(LPDS)的制备

1.研究目的

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

第二部分蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对胆固醇生物合成关键酶HMG-CoA还原酶合成和降解的影响

1.研究目的

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

第三部分蜂蜡素及其主要成分三十烷醇和二十八烷醇对人HepG2细胞总蛋白的影响

1.研究目的

2.材料和方法

3.结果

4讨论

总结

参考文献

综述：中药调血脂和抗动脉粥样硬化研究概况

附图

致谢

附录