甘薯叶过氧化物酶的分离纯化、部分性质及固定化研究

摘要

过氧化物酶(Peroxidase，POD，EC1.11.1.7)是广泛存在于各种生物体内的一类氧化还原酶，催化由过氧化氢参与的多种还原剂的氧化反应，属于含血红素的氧化酶。过氧化物酶可以用作检测试剂，广泛应用于食品、医学、工业等领域的检测，还可以用于治理环境污染等。
　　 本研究以新鲜甘薯叶为原料，经过组织捣碎、缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、超滤和DEAE-Sepharose离子交换层析以及Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析等步骤，得到了电泳纯的甘薯叶POD。该酶比活力为91923.14U/mg，纯化倍数为255.69，回收率为1.59％。经过SDS-PAGE以及Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析，测得该POD的相对分子质量约为35kD。
　　 用过氧化氢及愈创木酚作底物测定酶活，发现该酶的最适pH值为5.6，最适温度为60℃。该酶在20～50℃、pH4～8内稳定。以不同浓度H202为底物在pH7.2和25℃下测得该酶Km值为0.291mol/L。低浓度草酸、尿素、Li+、Na+、K+、Mg2+等对该酶有激活作用；SDS、KSCN、抗坏血酸(AsA)、Mn2+等对该酶有抑制作用；有机溶剂甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇对POD均有一定抑制作用，其抑制作用强弱顺序为异丙醇＞乙醇＞甲醇＞乙二醇。
　　 用化学修饰剂对该酶的功能基团进行修饰，发现巯基以及二硫键可能是其活性中心的必需基团，而精氨酸残基、甲硫氨酸硫醚基、组氨酸残基、赖氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸酚羟基可能不是该酶活性中心的必需基团。
　　 采用聚乙烯醇-海藻酸钠为载体、饱和硼酸作交联剂、CaCl2作固定剂对酶进行固定化，经过单因素实验探究了海藻酸钠浓度、加酶量、CaCl2浓度和固定化时间对固定化的影响，再通过正交优化实验探究了这几个因素对固定化影响的大小以及各因素的最佳水平组合。四个因素的最佳水平分别为0.2％PVA-3％CA、载体与酶液比例为3：1、饱和硼酸-4％CaCl2、固定化时间15min。用上述四因素的最佳水平组合固定化酶后，对固定化酶的部分理化性质以及重复使用稳定性、保存稳定性进行了测定。发现固定化后酶的最适温度升高，保存稳定性也升高，但重复使用性不好。

目录

文摘

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声明

第一部分 文献综述

1.1过氧化物酶的分布及分类

1.2过氧化物酶的分子结构特点

1.3 POD的催化反应机理

1.4酶活力的测定

1.5 POD的分离纯化

1.6酶的化学修饰

1.7酶的固定化

1.8 POD的生理功能

1.9 POD的应用

第二部分 引言

2.1研究的选题依据

2.2研究的思路和主要内容

2.3研究的技术路线

第三部分 甘薯叶过氧化物酶的分离纯化及性质研究

3.1材料与试剂

3.2实验方法

3.3结果与分析

第四部分 甘薯叶过氧化物酶功能基团的研究

4.1材料与方法

4.2实验结果与分析

第五部分 甘薯叶过氧化物酶的固定化研究

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与分析

第六部分 讨论

6.1甘薯叶POD的分离纯化

6.2甘薯叶POD的性质研究

6.3 POD的固定化研究

6.3.1固定化的条件探究

6.3.2固定化酶的性质研究

第七部分 结论及展望

7.1甘薯叶POD的分离纯化

7.2甘薯叶POD的酶学性质与功能基团研究

7.3甘薯叶POD的固定化研究

7.4展望

参考文献

致谢