马铃薯甲虫的虫生真菌分离及其生防菌的筛选鉴定

摘要

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)是重要的外来入侵物种和检疫性害虫，国外已开发出多杀菌素等防治马铃薯甲虫的生物杀虫剂，但由于马铃薯甲虫传入我国不久，对其致病微生物的研究国内尚未见报道。因此本研究从新疆马铃薯甲虫发生地采集感病成虫样品，在室内分离昆虫病原菌，并经致病性测定筛选出2个强致病白僵菌菌株，用形态及分子生物学技术鉴定强致病菌，并研究它们的培养特性，最后进行温室盆栽和大田试验测定这2个菌株的防治效果。
　　 马铃薯甲虫病原菌的分离：从新疆大量采集感病马铃薯甲虫，采用常规昆虫真菌分离法从虫体上分离纯化后获得47个真菌菌株，初步形态学鉴定分别属于白僵菌(Beauveria)、轮枝菌(Verticillium)、镰刀菌(Fusarium)、青霉(Penicillim)、木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)属等。
　　 不同菌株对家蚕的致病性测定：用真菌悬浮液(浓度：1.05×109个/mL)接种家蚕2龄幼虫，结果表明有36个菌株对家蚕有不同程度的致病性，其中白僵菌30株、轮枝菌3株、镰刀菌2株和木霉1株，白僵菌菌株中MJ-07的致病力最强，接种后11d的累积死亡率达到95.6％，致死中时(LT50)为7.5d；轮枝菌MJ-20接种后11d的累积死亡率和LT50分别为61.5％和9.1d；镰刀菌MJ-27和木霉MJ-32的致病力较弱，其接种11d的累积死亡率仅为8.6～11.0％。
　　 本试验结果为进一步到新疆进行马铃薯甲虫致病性测定奠定了基础，同时也为今后有关地区在应用病原菌控制马铃薯甲虫时注意保证养蚕业的安全提出了警示。真菌菌株对马铃薯甲虫的致病性：用家蚕初步筛选获得的36个菌株的分生孢子悬浮液(浓度：1.1×109个/mL)分别接种马铃薯甲虫2龄幼虫后观察，它们都具有不同程度的致病力。轮枝菌(Verticillium)、镰刀菌(Fusarium)和木霉(Trichoderma)菌株的致病力比较弱，接菌9d后的虫体累计死亡率(LR9d)只有4.3～11.3％。多数白僵菌Beauveria)菌株的致病力都较强，其中有5株白僵菌(MJ-01、MJ-03、MJ-07、MJ-08、MJ-09)的致病力非常强，LR9d达到82.3～93.3％，致死中时(LT50)和致死中浓度(LC50)分别为6.71～7.53d和4.53×106-5.89×107mL-1。选择致病力最强的MJ-07和MJ-09菌株作进一步试验，观察它们对成虫和各龄幼虫的致病性。结果表明，MJ-07菌株对1龄、2龄幼虫和成虫的致病性都很强，接菌后5d初见虫体死亡，LR9d分别为100％、93.4％和98.0％；而对3龄和4龄幼虫的致病性相对较弱，LR9d各为70.0％和43.3％；死亡的虫体缩小，后期产生大量分生孢子完全包被虫体。MJ-09对1龄和2龄幼虫的致病性很强，接菌后5d始见虫体死亡，LR9d分别达100％和90.0％；而对3龄和4龄幼虫和成虫的致病性较弱，接种后7d才开始见虫体死亡，LR9d分别只有63.3％、33.0％和13.3％；刚死亡的虫体完全变黑，后期产生的分生孢子量不如MJ-07致死的虫体产孢量大，不能完全包被虫体。
　　 本研究结果认为，MJ-07和MJ-09是马铃薯甲虫的强致病力菌株，在马铃薯甲虫的生物控制中将具有潜在的开发应用价值。菌株MJ-07和MJ-09对马铃薯甲虫的控制效果测定：通过前期室内致病性试验，选致病性最强的2株白僵菌(MJ-07和MJ-09)进行室内盆栽和田间防效试验。
　　 1.室内盆栽结果表明，2个菌株对1龄和2龄幼虫的致死率显著高于3龄幼虫，喷施MJ-07菌悬液15d后的各龄幼虫的死亡率分别为65.5％、61.8％和30％；而喷施MJ-09菌悬液15d后的死亡率分别为62.3％、57.2％和25％。
　　 2.选择1龄和2龄CPB幼虫进行田间试验，喷施MJ-07菌悬液15d后的死虫率分别为45％和41.6％；喷施MJ-09菌悬液15d后的死虫率分别为40.2％和38.3％；作为对照白僵菌制剂的致死率仅有30％，2个菌株的田间致病性高于对照白僵菌制剂，表现出很好的害虫控制效果。
　　 白僵菌形态学和分子生物学鉴定：在SDAY培养基上培养菌落呈茸毛状，MJ-07培养初期多呈白色且菌落较厚，MJ-09菌落淡黄色，背面无色，或淡黄色。气生菌丝透明、光滑、薄壁，分枝较少且较纤细，宽1.8～2.8μm；分生孢子梗着生在菌丝上，粗1～2μm，产孢细胞常着生于短的并稍有膨大的柄细胞上，常呈浓密的菌丛，基部多为球形、近球形至梭形膨大；产孢轴较长，呈“之”字形弯曲。分生孢子单孢、壁薄、透明、光滑，多为球形、近球形，直径2～3×2～2.5μm。采用真菌通用引物对(ITS4和ITS5)，通过聚合酶链式反应(PCR)分别对菌株MJ-07和MJ-09的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)的特异性扩增，得到了长度分别为581bp和537bp的特异性片段(GenBank登录号分别为GU233851和GU989641)，Blast比对后结合形态学特征鉴定它们的无性时期均为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，有性时期为球孢虫草菌(Cordyceps bassiana)。
　　 白僵菌菌株主要培养特性：在供试的8种培养基中，SDAY培养基最适MJ-07和MJ-09菌株生长，其产孢强度也最大；6个温度处理中最适生长温度为25℃，孢子萌发最适温度25～28℃；菌株在供试的9种碳源和9种氮源中，对葡萄糖和蔗糖2种碳源及胰蛋白胨和酵母浸膏2种氮源利用最好；菌株在全光照条件下菌丝生长最好及产孢量最大；分生孢子的致死条件为55℃处理10min；紫外光照射对分生孢子萌发有显著影响，照射60min时，24h内没有孢子萌发；分生孢子在2％葡萄糖+1％蛋白胨培养基中萌发最早。5种常用马铃薯甲虫杀虫剂对MJ-07和MJ-09生长产孢的试验结果显示，5种供试杀虫剂对2个菌株的菌落生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用。其中高效氯氟氰菊酯和吡虫啉对2个菌株的抑制作用较小，对MJ-07的孢子萌发抑制率分别为9.5％和13.5％，对MJ-09孢子萌发率分别为10.9％和13.3％；而灭多威、啶虫脒、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对2个菌株均有较强的抑制效果。因此在田间应用时应注意杀虫剂对白僵菌的抑制作用。
　　 虫生真菌(entomogenous fungi)是自然界广泛分布的一类珍贵的生物资源。随着科学技术的发展和绿色植保方针的提出，生物防治在马铃薯甲虫的综合治理中发挥重要的作用，本研究中筛选鉴定的2个白僵菌菌株具有明显的应用潜力，安全有效的马铃薯甲虫真菌杀虫剂将来会被研制出来并广泛应用于马铃薯甲虫的控制实践。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 马铃薯甲虫概述及虫生真菌的应用现状

1马铃薯甲虫简述

1.1马铃薯甲虫的起源和扩散

1.2马铃薯甲虫在新疆的发生与危害

1.3马铃薯甲虫的形态特征

1.4马铃薯甲虫防治现状

2虫生真菌的研究与利用

2.1虫生真菌的资源及主要种类

2.2昆虫病原真菌侵染昆虫的过程

3虫生真菌分子生物学技术研究现状

4虫生真菌的应用

5真菌杀虫剂的生产工艺与产品规范化

6虫生真菌应用上存在的一些问题及对策

7虫生真菌研究与生防应用前景展望

8本研究的主要内容

第二章 马铃薯甲虫病原菌的分离及对家蚕的致病性

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1马铃薯甲虫病原菌种类

2.2不同真菌菌株对家蚕的致病性结果

3结论与讨论

第三章 马铃薯甲虫病原菌的室内致病性试验与强致病菌株筛选

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1不同真菌菌株对马铃薯甲虫幼虫致病力

2.2白僵菌强毒力菌株对马铃薯甲虫幼虫室内毒力分析

2.3白僵菌菌株MJ-07和MJ-09对马铃薯甲虫各虫态的致病症状和毒性比较

3结论和讨论

第四章 马铃薯甲虫病原菌MJ-07和MJ-09对马铃薯甲虫的防效

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1 MJ-07和MJ-09对马铃薯甲虫幼虫室内控制作用

2.2 MJ-07和MJ-09对马铃薯甲虫的田间防效分析

3结论和讨论

第五章 马铃薯甲虫病原菌的鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

1.2病原菌的形态学鉴定

1.3病原菌的分子生物学鉴定

2结果与分析

2.1马铃薯甲虫重要病原菌的形态特征鉴定

2.2马铃薯甲虫病原菌rDNA ITS区段PCR扩增结果与病菌鉴定

3结论与讨论

第六章 马铃薯甲虫病原菌MA-07和MJ-09的培养特性

1材料与方法

1.1供试材料

1.2实验方法

1.3统计分析方法

2结果与分析

2.1不同培养基对菌落生长、产孢和萌发的影响

2.2温度对菌株生长特性的结果分析

2.3不同光照条件下菌丝生长、产孢和分生孢子萌发特性

2.4不同碳、氮源下的菌株生长特性

2.5紫外光照射对分生孢子萌发的试验结果

3结论与讨论

第七章 常用马铃薯甲虫杀虫剂对白僵菌MA-07和MJ-09生长产孢的影响

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

2 结果与分析

2.1 5种杀虫剂对菌株MJ-07和MJ-09菌落生长和产孢的影响

2.2 5种杀虫剂对MJ-07和MJ-09菌株孢子萌发率的影响

3结论与讨论

第八章 结论与展望

1结论

2展望

参考文献

附录及附图

致谢

学习期间发表论文及参加课题