巴马香猪肝硬化形成过程中细菌移位的初步研究

摘要

1.研究背景及目的
　　 肝硬化(cirrhosis of liver)是一种以肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成为特征的慢性肝病，也是我国常见疾病和主要死亡病因之一。临床上有多系统受累，以肝功能损害和门静脉高压为主要表现，肝硬化常伴随肠源性感染，研究表明其感染的主要的来源是肠道细菌，以肠杆科细菌为主。本研究基于临床采样难，在治疗过程中使用抗生素等药物的原因基础之上，采用经典的四氯化碳加饲喂酒精的方法制备肝硬化动物模型，更好地模拟人患肝硬化，以期研究肝硬化形成过程中细菌移位情况，建立移位菌种库，为进一步研究临床肝硬化、肠源性感染以及肝移植患者的治疗和预后提供基础参考数据。
　　 CCl4诱导的肝病模型多用来研究肝纤维化的细胞及分子机制、血清学标志物、组织病理及抗纤维化物质的药效评价。目前CCl4诱导的小型猪肝病模型用来研究动物肠道微生态失衡与感染性疾病之间关系的文献还未见报到。本研究旨在探讨在肝硬化形成过程中细菌移位情况。为进一步探讨细菌移位发生机制，寻找临床细菌移位防治措施，对改善肝硬化病人生活质量有重要的现实意义。
　　 2.研究内容和结果
　　 2.1研究内容
　　 2.1.1巴马香猪肝硬化模型的制备方法
　　 3月龄巴马香猪16头(由第三军医大学基础部实验动物学教研室提供)，模型组6头雄性，4头雌性，共10头；对照组5头雄性，1头雌性，共6头，均未阉割，体重为12.0±1.9 kg。饲喂玉米面，适应性饲养2周后，模型组自由饮用10％的酒精，腹腔注射40％CCl4橄榄油溶液，注射剂量按每千克体重0.25 ml溶液，每4天1次。
　　 2.1.2肝硬化形成过程中移位细菌的鉴定方法
　　 经过肝穿病理切片初步判断已有肝硬化形成的巴马香猪，于无菌条件下，剖腹取内脏器官，于超净台研磨成组织浆液，接种于总菌(BHI)固体培养基，进行普通细菌培养，37℃条件下培养24-48h。基于16S rRNA基因的可变区---V3区设计引物，然后通过PCR-DGGE初步筛选带型一致的，将其对应的PCR产物进行核苷酸测序，从而鉴定移位细菌。
　　 2.2研究结果
　　 2.2.1巴马香猪肝硬化模型
　　 历时6个月成功诱导巴马香猪肝硬化模型6头，成模率达60％，死亡率20％。
　　 2.2.2移位细菌菌种库的构建
　　 所得序列通过GenBank(网址：http：//www.Ncbi.him.nih.Gov)进行同源性比较。结果显示肝硬化模型组移位细菌主要是以肠杆菌科的肠杆菌属、埃希氏菌属、爱德华氏菌属为主，其次是革兰氏阳性兼性厌氧的葡萄球菌属、棒杆菌属、肠球菌属、链球菌属，如：金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、解没食子酸盐链球菌，以及严格厌氧的革兰氏阴性巨大球菌属的解酪蛋白巨大球菌、棒状杆菌等厌氧菌。移位到肠系膜淋巴结的数量最多，多达8340CFU/g，其次是肝脏，再次是肾脏，移位细菌最少的就是肺部。正常对照组肝、脾、肠系膜淋巴结均无细菌生长。
　　 3.结论
　　 3.1成功获得了小型猪肝硬化动物模型，证明了肝硬化形成过程中伴随肠道细菌移位的发生，并成功构建了移位菌菌种库。
　　 3.2移位细菌核酸序列在GenBank中比对结果显示革兰氏阴性菌占47.1％，革兰氏阳性菌占58.3％；83.3％是兼性厌氧菌，16.7％是需氧菌。其中大肠埃希氏菌占30.1％，葡萄球菌属占25.0％，棒状杆菌属占8.33％，巨大球菌属占8.33％等等。
　　 3.3从移位部位来看，移位到血液、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结的细菌数量占移位总菌的比率分别是7.94％、12.98％、8.05％、7.68％、9.40％、53.95％。
　　 3.4为进一步寻找临床细菌移位防治措施提供基础参考。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

文献综述:肝硬化合并细菌移位的研究进展

引言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4讨论

5小结:

6参考文献

附录：所测菌株核酸序列峰图

致谢

在学期间发表文章及申请专利