家蚕肠道微生态产脂肪细菌的分离鉴定与差异性比较

摘要

昆虫肠道系统是一个伴随取食、消化、排泄等活动而多变的微环境，其中寄居着大量的微生物，这些微生物在宿主的营养、发育、生殖及对病原微生物的抗性中具有重要作用。相对于哺乳动物，昆虫肠道微生物功能的研究相对较慢，目前较为深入的研究仅集中在一些特殊的类群如白蚁和沙漠蝗。这些微生物及其代谢产物对昆虫宿主的生长发育具有重要影响，如降解纤维素、生成甲烷、耗氢将CO2还原为乙酸盐、固氮、维持较低的氧化还原势能，同时在抵抗病原微生物的侵袭与定植中也起着重要作用。然而，对其它种类昆虫肠道微生物功能的研究则较少。鳞翅目昆虫作为昆虫纲的一个重要类群，目前仅有一些研究表明鳞翅目昆虫肠道中栖息着大量的微生物菌群并且这些微生物可能产生消化酶为宿主提供营养物质。
　　 家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物，并且是一类具有重要经济价值的泌丝昆虫。家蚕属于寡食性昆虫，主要以桑叶为食，但柘叶也可以作为其代用饲料。最近研究发现，4龄起蚕用柘叶替代桑叶饲养家蚕，家蚕不但生长发育缓慢，而且极易感染家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。但是，有研究报道指出家蚕消化液中的脂肪酶具有较强的抗BmNPV活性。因此，本试验用柘叶饲养家蚕来构建BmNPV敏感模型，采用分子生物学方法和常规传统方法相结合的鉴定技术，以探讨BmNPV敏感和不敏感家蚕其肠道优势菌、特别是脂肪酶产生菌的多样性和差异性，为进一步研究和探讨家蚕抗病性与其肠道脂肪酶产生菌的关系奠定基础。
　　 试验结果如下：
　　 1.通过纯培养分离方法从桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共获得56株优势菌。这些优势菌按照菌落形态和菌体特征可分为12类，其中桑叶饲养家蚕肠道中的优势菌表型有10类，柘叶饲养家蚕肠道中的优势菌表型有7类，它们共有的优势菌表型有4类。
　　 2.通过形态学、生理生化、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析，这12类优势菌分别属于气单胞菌属(Aeromonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)。其中葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacte)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和短波单胞杆菌属(Brevundimonas)4个类型是桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共有的优势菌群；气单胞菌属(Aeromonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)5个类型是桑叶饲养家蚕肠道中特有的优势菌群；柘叶饲养家蚕肠道中特有的优势菌群仅有两类，分别是土壤杆菌属(Agrobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)；而芽孢杆菌属(Bacillus)只是4龄家蚕肠道中共有的优势菌类型。
　　 3.通过在罗丹明B琼脂平板上筛选56株优势菌，从桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共获得9株产脂肪酶的菌株。这9株脂肪酶产生菌经鉴定分属于6个菌属，分别是芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。其中寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)是桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共有的脂肪酶产生菌，其它5个菌属仅在桑叶饲养家蚕肠道中存在。结果显示，不同饲料饲养家蚕其肠道脂肪酶产生菌的多样性存在较大差异，柘叶饲养家蚕其肠道脂肪酶产生菌的类型远不如桑叶饲养家蚕肠道中的丰富。
　　 4.家蚕肠道脂肪酶产生菌通过在体外发酵培养48 h左右达到最大菌体浓度。然而，它们的最大菌体浓度存在较大差异，其中SW41的最大菌体浓度最高，SW72的最大菌体浓度最低。此外，脂肪酶产生菌在其细胞浓度达到最大值时，所产脂肪酶酶活力也达到最高值。其中SW41的最大总酶活力最高，为249.59 U/L；SW54的最大总酶活力最低，为77.46 U/L。