外源抗病基因和单宁代谢合成关键酶基因LAR3在毛白杨中协同抗病机理研究

摘要

毛白杨系我国重要的民用和工业用材。随着其大面积的栽培，各种病害日益严重。单纯依靠常规育种和喷洒化学农药的方法不能有效地解决杨树病害的问题。因此，利用植物基因工程技术培育毛白杨抗病新品种已成当务之急。在已利用的抗真菌基因中，几丁质酶和阳离子抗菌肽显示出了一定的优势。本研究将益母草脂质转移蛋白基因LJAMP2以及球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1分别转入毛白杨，获得转基因植株，抗病实验显示其对真菌病具有良好的抗病效果。研究内容如下：
　　 1、根癌农杆菌介导的LdAMP2、Bbchit1基因对毛白杨遗传转化及分子检测
　　 以毛白杨为转基因受体材料，利用根癌农杆菌介导法转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因LJAMP2和球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1。经卡拉霉素筛选，分别获得大量抗性植株。GUS组织染色和PCR检测15株转LJAMP2植株、16株转Bbchit1抗性植株，均呈阳性，初步证明外源目的基因都已整合到毛白杨的基因组中。RT-PCR证实LJAMP2和Bbchit1基因在转基因植株中均能大量表达。
　　 2、转LJAMP2基因毛白杨抗病性检测
　　 离体抗病性试验表明，转LJAMP2基因毛白杨细胞粗提液对四种病原真菌(黑斑病菌、炭疽病菌、烂皮病菌、溃疡病菌)的抑菌能力明显强于非转基因植株。进一步将黑斑病菌、炭疽病菌接种在转基因和野生型毛白杨叶片上培养，发现野生型和转空载体pBI121植株感病快且面积大；而转LJAMP2基因植株仅部分叶片少面积感病。茎段上分别接种烂皮病菌、溃疡病菌，保湿培养30 d后，发现非转基因毛白杨发病严重，茎段出现明显的腐烂症状，多数植株最终枯死。而转LJAMP2基因株系表现出高抗，叶片枯斑很少，茎段感病症状显著缓解，植株整体生长情况良好。上述抗性试验结果表明，在毛白杨中超量表达LJAMP2基因能显著提高其对四种病原真菌的抗病性。
　　 3、转Bbchit1基因毛白杨抗病性检测
　　 对转Bbchit1基因毛白杨进行离体及活体抗病性试验，结果表明其对炭疽病、烂皮病、溃疡病的抗病效果与转LJAMP2基因毛白杨相似，但对黑斑病的抑制效果优于转LJAMP2基因毛白杨。
　　 前人研究表明，植物中类黄酮(尤其是单宁)可有效防御病害的威胁。在杨树中，本研究从分子水平分析发现，类黄酮合成途径中绝大部分功能基因在遭受病害后转录水平均明显增加，特别是单宁合成途径中关键酶基因表达丰度增加尤为明显。在前期工作中，本实验室已成功克隆杨树单宁代谢途径中关键酶基因LAR3，将该基因导入毛白杨，其表达量显著增加，单宁的合成量提高，转基因杨树对黑斑病的抗性明显增强。
　　 本研究进一步将球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1通过二次转化转入LAR3超量表达毛白杨中，获得LAR3和Bbchit1共表达转基因毛白杨，研究其协同抗病作用，期望为培育抗病杨树品种打下基础。研究内容如下：
　　 1、根癌农杆菌介导的Bbchit1基因对超量表达LAR3毛白杨二次转化及分子检测
　　 以超量表达LAR3毛白杨为转基因受体材料，利用根癌农杆菌介导法转化来源于球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1。经卡拉霉素筛选，获得大量抗性植株。GUS组织染色和PCR检测得到8株LAR3和Bbchit1共表达转基因毛白杨，初步证明外源目的基因都已整合到毛白杨的基因组中。RT-PCR证实LAR3和Bbchit1基因在转基因植株中均能大量表达。
　　 2、LAR3和Bbchit1共表达转基因毛白杨的抗病分析
　　 将黑斑病菌接种到PDA培养基上培养2 d，结果发现，在含野生型植株细胞粗提液的PDA培养基上，菌圈的直径较大，而在含转基因植株细胞粗提液的培养基上菌圈直径明显减小，其中LAR3和Bbchit1共表达转基因毛白杨抑菌效果最为明显。进一步对转基因毛白杨进行活体抗病效果分析，分别在各植株叶片上接种黑斑病菌，放于室外保湿培养，发现野生型和转空载体pBI121植株感病快且面积大；而超量表达LAR3毛白杨和转Bbchit1基因植株仅部分叶片小面积感病，LARd和Bbchit1共表达转基因毛白杨仅接种菌块处感病。表明LAR3和Bbchit1基因可在毛白杨中协同抗真菌病。
　　 3、转基因毛白杨中总黄酮及单宁含量的测定
　　 为了进一步验证黄酮类化合物与抗病性相关，黑斑病处理12 d前后，分别测定各株系总黄酮及单宁含量，结果发现：在处理前，LAR3和Bbchit1共表达转基因毛白杨具有较高的总黄酮和单宁含量，超量表达LAR3株系次之，再次是转Bbchit1基因毛白杨，野生型和空载体pBI121植株总黄酮和单宁含量相对较低；病害处理后，总黄酮及单宁含量均不同程度增加。上述结果表明总黄酮及单宁含量与抗病性呈正相关。